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摘 要： [摘要]目的：研究小葉女貞果實中山柰酚的酸水解提取條件，建立高效液相色譜法測定小葉女貞果實中的山柰酚含量的方法，并分析不同來源藥材中山柰酚的含量差異。方法：小葉女貞果實經體積分數為20%的鹽酸-甲醇溶液(1：4)水解提取后，用高效液相色譜法測定其水
[摘要]目的：研究小葉女貞果實中山柰酚的酸水解提取條件，建立高效液相色譜法測定小葉女貞果實中的山柰酚含量的方法，并分析不同來源藥材中山柰酚的含量差異。方法：小葉女貞果實經體積分數為20%的鹽酸-甲醇溶液(1：4)水解提取后，用高效液相色譜法測定其水解液中的山柰酚的含量。以InertsilODS-SP(5μm，250×4.6mm)色譜柱，乙腈-0.3%磷酸水溶液(37：63)為流動相進行等度洗脫，流速為1.000ml/min，檢測波長為370nm;柱溫為35℃。結果：實驗的方法學考察結果表明，山柰酚進樣量在0.192～1.152μg范圍內的峰面積與吸光度有良好線性關系，其回歸方程為y=5E+06x+18.723，r=0.9998;平均回收率為98.64%(RSD%=1.89，n=6);在此測定條件下穩定性試驗的RSD為1.52%，樣品溶液在24h內穩定，重復性試驗的RSD為1.42%，該測定方法的重現性較好;9批不同來源小葉女貞果實樣品中山柰酚含量有一定差異，平均含量為0.3506mg/g，RSD為0.18%。結論：酸水解提取-高效液相色譜法可用于小葉女貞果實中山柰酚的含量測定。
[關鍵詞]高效液相色譜法;小葉女貞果實;山柰酚;含量測定
小葉女貞(LigustrumquihoniCarr.)又名小葉冬青，在全國各地均有分布，資源豐富。其根葉可入藥，具有清熱解毒的功效，可治療外傷、燙傷等癥。經文獻檢索和資料查閱，該植物果實的藥用未發現有文獻記載。據文獻報道小葉女貞中含有齊墩果酸、熊果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素、山柰酚及揮發油等化合物;其提取物具有免疫調節、止咳平喘及清除自由基的作用;山柰酚的抗菌、抗病毒、抗炎、抗感染、抗氧化、抗癌、對動脈粥樣硬化及糖尿病的防治作用備受關注。小葉女貞果實中山柰酚至今尚未見有含量測定的報道。本實驗建立了HPLC測定小葉女貞果實中山柰酚的方法，該方法簡便易行、結果準確、重復性好。
1 實驗材料
1.1 儀器
LC-20A色譜儀(島津)，SPD-M20A二極管陣列檢測器(島津);MS105型分析天平(梅特勒-托得多儀器有限公司);K-Q500E型醫用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);TG16-WS臺式高速離心機(鄭州宏朗儀器設備有限公司);DZKW-4電子恒溫水浴鍋(上�？莆鲈囼瀮x器廠)。
1.2 藥品及試劑
山柰酚對照品(批號為ST0105，上海如吉生物科技);乙腈為色譜純(德國默克公司)，其余所用試劑均為分析純。
1.3 藥材
藥材9批，于冬至前采集，經天然藥物教研室陸鴻奎副教授鑒定為木犀科女貞屬植物小葉女貞(LigustrumquihoniCarr.)的果實。
2 方法與結果
2.1 對照品溶液的制備
取山柰酚對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解制成每1ml含山柰酚0.0960mg的對照品溶液，即得。
2.2 供試品溶液制備
取藥材樣品粗粉(過2號篩)1g，精密稱定，用石油醚50ml回流1小時，藥渣揮干石油醚后，加入20%鹽酸溶液15ml，乙酸乙酯60ml水浴回流提取1小時，濾過，濾液用40%氫氧化鈉溶液調節pH5～6后于水浴濃縮至干。殘渣用甲醇溶解，于15000r/min離心10min，定容為50ml，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液作樣品溶液。
2.3 色譜條件
用InertsilODS-SP(5μm，250×4.6mm)色譜柱，在370nm波長、35℃柱溫條件下，進樣10μl，流速為1.000ml/min，以乙腈-0.3%磷酸水溶液(37：63)為流動相進行洗脫。
2.4 系統適應性試驗
分別精密吸取2.1和2.2項下制備的對照品和供試品溶液各10μl，按2.3色譜條件項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，色譜圖見圖1。結果，供試品中山柰酚色譜峰的保留時間為9.09與對照品溶液一致，分離度均大于1.5，理論塔板數不低于4000，溶劑空白無干擾。色譜圖見圖1。
2.5 線性關系考察
按2.3色譜條件項下方法，精密吸取2.1項下的對照品溶液1，2，3，4，5，6，12μl，分別注入液相色譜儀，測得山柰酚面積的回歸方程為y=5E+06x+18.723，r=0.9998。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，在上述色譜條件下，山柰酚進樣量在0.096～1.152μg范圍內與峰面積的線性關系良好。山柰酚線性關系見圖2。
2.6 精密度試驗
分別吸取2.1項下的對照品溶液10μl，按2.3項下色譜條件測定6次，其峰面積RSD為1.63%，表明儀器精密度良好。
2.7 穩定性試驗
取同一批藥材(采于楚雄醫專校園內的藥材)，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0，2，4，8，12，24h進樣10μl，測得山柰酚的峰面積RSD為1.52%，表明供試品溶液在24h內穩定。
2.8 重復性試驗
取同一批藥材粗粉(過2號篩)6份，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取各10μl注入高效液相色譜儀，按2.3項下色譜條件進行含量分析，山柰酚質量分數的RSD為1.42%，表明該測定方法的重復性良好。
2.9 加樣回收率試驗
取已知山柰酚含量的藥材粗粉(過2號篩)6份，精密稱定，每份約2g，分別加入山柰酚對照品適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，測得山柰酚的平均回收率為98.64%(n=6)，RSD=1.89，結果見表1。
2.10 樣品測定
取藥材樣品粗粉(過2號篩)1g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取10μl，按2.3項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算山柰酚含量。同法測定9批樣品(批號見表2)，每批樣品平行測定三次，其測定結果的平均值見表2。
3 討論
在提取條件的選擇中，為藥材中的山柰酚由苷水解為游離狀態，常在提取溶劑中加入一定量的酸進行水解。筆者考察了甲醇-2%鹽酸、乙醇-2%鹽酸、乙酸乙酯-2%鹽酸等為提取溶劑進行回流和超聲提取，結果顯示，以乙酸乙酯-2%鹽酸(4：1)為溶劑進行超聲提取效果最佳。洗脫劑的選擇，考察了不同比例的乙腈-0.3%磷酸水溶液的等度和梯度洗脫的情況，最終選擇用乙腈-0.3%磷酸(37：63)洗脫進行等度洗脫分離較好。用二極管陣列檢測器對山柰酚用上述條件在波長200～400nm繪出3D圖譜，結果山柰酚于370nm波長處的HPLC色譜響應較大，同時各色譜峰分離度較好，故選擇370nm為檢測波長。
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建立的方法穩定性、回收率、重復性和分離效果較好，能快速、準確地測定小葉女貞果實中山柰酚的含量，可用于小葉女貞果實中山柰酚的含量測定。
