發(fā)布時間：2019-12-06所屬分類：農(nóng)業(yè)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:采用水蒸氣蒸餾法提取野菊花揮發(fā)油成分，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定了其中36種化學(xué)成分，主要為萜類化合物及其衍生物，其中姜黃烯和氧化石竹烯相對含量較高，均占10%以上.分別采用不同的抗菌活性檢測模型測定了野菊花揮發(fā)油的抑菌活性.結(jié)果顯示:野菊
摘要:采用水蒸氣蒸餾法提取野菊花揮發(fā)油成分，通過氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定了其中36種化學(xué)成分，主要為萜類化合物及其衍生物，其中姜黃烯和氧化石竹烯相對含量較高，均占10%以上.分別采用不同的抗菌活性檢測模型測定了野菊花揮發(fā)油的抑菌活性.結(jié)果顯示:野菊花揮發(fā)油對3株革蘭氏陽性葡萄球菌和2株革蘭氏陰性腸道桿菌的生長均表現(xiàn)出一定抑制活性，且對革蘭氏陽性球菌的抑制能力稍強(qiáng)于陰性桿菌.帶毒平板法活性測定結(jié)果表明，野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制活性，其抑制中濃度(IC50)值為0.02mg/mL.
關(guān)鍵詞:野菊花;揮發(fā)油;氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);抗菌活性;立枯絲核菌
0引言
植物揮發(fā)油屬于植物的次生代謝產(chǎn)物，大多來源于植物的莖、葉、花、果實、種子以及表皮等部位，可以通過物理壓榨、水蒸氣蒸餾、溶劑提取等方式收集提煉得到[1].研究表明，植物揮發(fā)油主要為萜類化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫類化合物等，其中萜類化合物為植物揮發(fā)油的主要組成成分[2].研究發(fā)現(xiàn)，植物揮發(fā)油具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及保護(hù)心血管等藥理作用[3-4]，其一直也是食品、醫(yī)藥以及農(nóng)業(yè)環(huán)保等多個領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5].
野菊為菊科多年生草本植物，廣泛分布于我國東北、華北、華中、華南及西南各地[6].野菊以全草入藥，具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱、明目降壓等功效，可以用于預(yù)防和治療感冒、肝炎、癰癤等疾病[7].野菊花為野菊的頭狀花序部分，是入藥主要部位，常用于提取分離藥效成分.目前對野菊花揮發(fā)油的研究多集中在其揮發(fā)性成分的分析檢測方面，對野菊花揮發(fā)油抗菌活性方面的研究相對較少.對此，本研究以野菊花為材料，提取其揮發(fā)性成分，同時采用不同抗菌活性檢測模型測定野菊花揮發(fā)油對細(xì)菌和真菌的抑制活性，擬為野菊花揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù).
1材料與方法
1.1材料
實驗所用材料包括:硫酸鏈霉素、多菌靈，購自Sigma公司;甲醇、氯化鈉、無水乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等試劑均為分析純，購自成都市科龍化工試劑公司;野菊花購自成都荷花池中藥材市場.
1.2菌株
1)細(xì)菌.白色葡萄球菌(ATCC8799)、表皮葡萄球菌(ATCC35984)、金黃葡萄球菌(ATCC6538)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC50115)、大腸桿菌(ATCC25922)，由成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供.
2)真菌.蕎麥立枯絲核菌，由成都大學(xué)農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實驗室提供.
1.3培養(yǎng)基
1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potatodextroseagar，PDA)用于真菌培養(yǎng)及活性測定，其配方為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，加去離子水定容至1000mL.
2)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(Nutrientbroth，NB)用于細(xì)菌的活化及活性測定，其配方為:氯化鈉5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去離子水定容至1000mL，pH值調(diào)節(jié)至7.4.
1.4儀器
實驗所用儀器包括:AUY-220型電子天平(島津公司)，SXKW型恒溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，DHG-9140B型恒溫鼓風(fēng)干燥箱、GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海瑯實驗設(shè)備有限公司)，UPT-II-20T型優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司)，LDZM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠).
1.5方法
1.5.1野菊花揮發(fā)油的提取.
野菊花于50℃低溫烘干，粉碎，采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發(fā)性成分.稱取一定量的野菊花干粉，按照料水比為1∶10(m/v)的比例，在微沸狀態(tài)下提取野菊花揮發(fā)油，每次持續(xù)5～6h.收集揮發(fā)油，往其中加入少許無水硫酸鈉，干燥，除去干燥劑后避光低溫保存，總共提取2kg野菊花干樣，稱重計算揮發(fā)油得率.
1.5.2野菊花揮發(fā)油的氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)分析.
1)色譜條件.色譜柱為毛細(xì)管柱，載氣為高純度氦氣，進(jìn)樣口溫度為290℃，壓力49.5kPa，總流量24.0mL/min，流速1.0mL/min，線速度36.1cm/s.
2)升溫程序.初設(shè)溫度40℃，保持5min;以10℃/min升至150℃，保持5min;以5℃/min升至225℃，保持5min;以5℃/min升至250℃，保持2min;以10℃/min升至300℃，保持15min;分流比為20∶1;檢樣器溫度220℃.
3)質(zhì)譜條件.EI(70eV)，離子源溫度為200℃，掃描范圍為33～700m/z.
1.5.3野菊花揮發(fā)油對細(xì)菌的抑制活性.
1)揮發(fā)油溶液的配制.稱取一定量的野菊花揮發(fā)油，溶于30%二甲基亞砜(DMSO)溶液中，配成初始濃度范圍在6.25～100mg/mL的系列溶液，4℃低溫保存，待測.
2)細(xì)菌活化.用接種環(huán)挑取少量菌種，接種到50mL營養(yǎng)肉湯中，于37℃下培養(yǎng)24～36h，用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至108CFU/mL.
3)利用微量稀釋法測定揮發(fā)油對細(xì)菌的抑制活性[8].吸取1mL上述菌液于新鮮的50mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，震蕩搖勻，在潔凈96孔板中加入90μL營養(yǎng)肉湯和10μL樣品溶液，每個濃度重復(fù)4次，30%DMSO為陰性對照，硫酸鏈霉素為陽性對照.4)在37℃下，培養(yǎng)24～36h后，用肉眼觀察細(xì)菌生長情況，判斷最低抑制濃度(MIC)值，即無細(xì)菌生長的孔所對應(yīng)的揮發(fā)油濃度為MIC值.在確定樣品的MIC基礎(chǔ)上，從MIC值所對應(yīng)的無菌生長的孔以及比MIC濃度更高的孔中各吸取20μL培養(yǎng)液，接種于瓊脂平板上，用三角玻璃涂布鏟輕輕平推，使液體均勻分布，隨后將平皿置于37℃培養(yǎng)24～36h，觀察有無細(xì)菌生長，以培養(yǎng)皿中計數(shù)少于5個菌落作為藥物的最低殺菌濃度(MBC).
1.5.4野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性.
1)樣品溶液的配制.準(zhǔn)確吸取一定量的揮發(fā)油置于潔凈離心管中，用12.5%DMSO溶液依次稀釋，使揮發(fā)油初始濃度范圍在5～40mg/mL，每個濃度溶液體積均為1mL.陽性對照為多菌靈，陰性對照為12.5%DMSO.
2)真菌活化.用接種針挑取蕎麥立枯絲核菌菌絲，接種至新鮮的PDA平板中央，25℃暗培養(yǎng)2～3d，待其菌絲剛好長滿平板.
3)利用帶毒平板法測定揮發(fā)油對立枯絲核菌的抑制活性[9].將PDA培養(yǎng)基加熱融化，待其溫度降至40～50℃時，將1mL樣品溶液加入裝有49mLPDA培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻，每個三角瓶倒3個平板，靜置.培養(yǎng)基凝固后，用無菌打孔器在上述長滿立枯絲核菌的平板上打孔，然后用接種針挑取菌餅接種到已凝固的培養(yǎng)基上，用封口膜將培養(yǎng)皿封口，于28℃下培養(yǎng)，48h后，采用十字交叉法測量菌落的直徑，記錄數(shù)據(jù)并計算相對抑制率.
4)數(shù)據(jù)統(tǒng)計.以供試樣品終濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率換算成幾率值為縱坐標(biāo)，求回歸方程(Y=aX+b)，并計算抑制中濃度IC50值.
2結(jié)果與討論
2.1野菊花揮發(fā)油主要成分分析
實驗采用水蒸氣蒸餾法提取干燥的野菊頭狀花序，收集得到淺藍(lán)色的野菊花揮發(fā)油成分，其具有野菊花的特殊香味，干燥后稱重計算揮發(fā)油得率為0.32%(w/w).經(jīng)GC-MS分析比對后，共鑒定出36種成分，主要為萜類化合物及其含氧衍生物以及脂肪族化合物，具體結(jié)果見表1.
由表1可知，相對含量較高的5種成分為姜黃烯(11.37%)、氧化石竹烯(10.53%)、胡椒酮(8.96%)、α-Copaen-11-ol(7.73%)和(S)-順式馬鞭草烯醇(6.39%)，其占總成分相對含量的44.98%.此外，左旋樟腦、左旋龍腦、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇、巴倫西亞橘烯等化合物的相對含量均在1%以上.
2.2野菊花揮發(fā)油對細(xì)菌的抑制活性
本研究采用微量肉湯稀釋法測定了野菊花揮發(fā)油對5種臨床常見致病細(xì)菌的抑菌活性，結(jié)果如表2所示.
表2數(shù)據(jù)顯示，在供試濃度范圍下，野菊花揮發(fā)油對3株革蘭氏陽性葡萄球菌和2株革蘭氏陰性腸道桿菌的生長均表現(xiàn)出了一定抑制活性.總體而言，野菊花揮發(fā)油對革蘭氏陽性球菌的抑制能力稍強(qiáng)于陰性腸道桿菌，對白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相對較好，其MIC值均為1.25mg/mL，MBC值為2.5mg/mL，對金黃色葡萄球菌的抑制活性稍弱，MIC值為2mg/mL，MBC值為2.5mg/mL.野菊花揮發(fā)油對鼠傷寒沙門氏菌的MIC和MBC值分別為2.5mg/mL和5mg/mL，其對大腸桿菌的MIC和MBC值分別為5mg/mL和10mg/mL.
2.3野菊花揮發(fā)油對立枯絲核菌的抑制活性
本研究采用帶毒平板法測定了野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性，結(jié)果如圖1所示.
圖1結(jié)果顯示，野菊花揮發(fā)油對立枯絲核菌菌絲生長具有很好的抑制作用，且隨著濃度增加，抑制作用隨之增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系.在設(shè)定終濃度為0.024mg/mL條件下，野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制率超過50%，而濃度為0.096mg/mL時，其對蕎麥立枯絲核病菌菌絲生長的抑制率高達(dá)80%.在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步測定了野菊花揮發(fā)油對立枯絲核菌的抑制中濃度，其IC50值為0.02mg/mL(回歸方程Y=1.7191X+1.3794).
期刊推薦：《成都大學(xué)學(xué)報》(自然科學(xué)版)是成都大學(xué)主辦的自然科學(xué)類綜合性學(xué)術(shù)刊物，國內(nèi)外公開發(fā)行，主要刊登生物與食品工程、電子工程、計算機(jī)工程、機(jī)械工程、土木與建筑工程、環(huán)境與能源工程及相關(guān)的交叉學(xué)科和相應(yīng)的基礎(chǔ)理論等自然科學(xué)和工程技術(shù)方面的學(xué)術(shù)論文、研究報告、綜述、技改成果等。
3結(jié)論
野菊為多年生草本藥用植物，在我國的分布較為廣泛.本研究采用水蒸氣蒸餾法提取制備了野菊花中的揮發(fā)性成分，并采用氣相色譜—質(zhì)譜(GCMS)聯(lián)用的方法對野菊花揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析鑒定.研究表明，野菊花揮發(fā)油的主要成分為萜類及其衍生物，其相對含量高于10%的成分主要為姜黃烯和氧化石竹烯.此外，胡椒酮、左旋樟腦、α-Copaen-11-ol、(S)-順式馬鞭草烯醇、左旋龍腦、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇和巴倫西亞橘烯等18個化合物的相對含量也在1%以上.同時，本研究采用不同的抗菌活性檢測模型測定了野菊花揮發(fā)油的抑菌活性，結(jié)果表明，野菊花揮發(fā)油對3種革蘭氏陽性葡萄球菌和2種革蘭氏陰性桿菌均表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其中揮發(fā)油對白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相對較好，其MIC值僅為1.25mg/mL，充分展現(xiàn)出了野菊花揮發(fā)油在醫(yī)藥領(lǐng)域有著較好的應(yīng)用潛力.此外，本研究首次報道了野菊花揮發(fā)油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性，其抑制中濃度IC50值低至0.02mg/mL，表現(xiàn)出了較好的開發(fā)利用價值，可為蕎麥立枯病等病害新型防治藥劑的研制提供新的思路.
