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摘 要： 摘要一氧化氮(NO)作為信號(hào)分子，在抵御重金屬脅迫中起重要作用，但對(duì)不同離子脅迫下的解毒機(jī)制尚缺乏研究.本研究采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法，研究了銅(Cu)、鎘(Cd)單一或復(fù)合脅迫下，番茄幼苗對(duì)Cu、Cd的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性及對(duì)外源NO的響應(yīng)機(jī)制.結(jié)果表明:50molL-1的Cu2+、Cd
摘要一氧化氮(NO)作為信號(hào)分子，在抵御重金屬脅迫中起重要作用，但對(duì)不同離子脅迫下的解毒機(jī)制尚缺乏研究.本研究采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)法，研究了銅(Cu)、鎘(Cd)單一或復(fù)合脅迫下，番茄幼苗對(duì)Cu、Cd的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性及對(duì)外源NO的響應(yīng)機(jī)制.結(jié)果表明:50μmol·L-1的Cu2+、Cd2+均顯著抑制番茄植株的生長(zhǎng)，其中Cd脅迫對(duì)生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)遠(yuǎn)高于Cu脅迫.Cu、Cd單一或復(fù)合脅迫均使番茄根系Cu、Cd含量顯著升高，但根系對(duì)Cu、Cd吸收存在嚴(yán)格選擇性.根細(xì)胞對(duì)必需元素Cu表現(xiàn)出“奢侈吸收”的現(xiàn)象，而對(duì)毒性較強(qiáng)的Cd則吸收相對(duì)較少，胞內(nèi)Cd濃度僅為Cu的1/10左右.外源NO處理可不同程度地緩解Cu、Cd脅迫，其中緩解Cd脅迫的效能更強(qiáng).番茄對(duì)被動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞的Cu、Cd具有相似的解毒機(jī)制:一方面，Cu、Cd脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生谷胱甘肽(GSH)、植物螯合肽(PCs)和金屬硫蛋白(MTs)，絡(luò)合過(guò)多的Cu、Cd離子，降低其生物毒性;另一方面，過(guò)多的Cu、Cd離子或螯合物被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡區(qū)隔化.外源NO通過(guò)調(diào)控GSH-GSSG(氧化型谷胱甘肽)氧化還原狀態(tài)及GSH-PCs代謝方向的改變，促進(jìn)Cu、Cd離子轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡區(qū)隔化來(lái)緩解脅迫抑制;NO還可誘導(dǎo)植株葉片或根系表達(dá)更多的金屬硫蛋白、GSH和PCs，而且上述響應(yīng)普遍存在疊加效應(yīng).這可能是NO介導(dǎo)番茄對(duì)Cu、Cd脅迫的另一主要解毒途徑.
關(guān)鍵詞番茄;銅脅迫;鎘脅迫;一氧化氮;谷胱甘肽;植物螯合肽
銅(Cu)是高等植物必需微量元素，同時(shí)也是重金屬，過(guò)量Cu會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用.Cu礦的開采和冶煉廠三廢的排放、含Cu農(nóng)業(yè)化學(xué)物質(zhì)(殺菌劑、殺蟲劑和化肥)和有機(jī)肥(高Cu豬糞、雞糞和廄肥)的施用常使農(nóng)田土壤，特別是溫室土壤含Cu量達(dá)到一般農(nóng)田土壤的幾倍乃至幾十倍[1-2].鎘(Cd)是植物非必需元素，且是毒性最強(qiáng)的重金屬，即使?jié)舛葮O低也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害.這些重金屬元素通常結(jié)合在生物大分子的活性位點(diǎn)，取代酶活性中心的金屬離子，改變酶的活性，從而破壞其代謝功能[3].植物螯合肽(phytochelatin，PCs)是細(xì)胞中廣泛存在的小分子多肽，富含半胱氨酸，其巰基可與細(xì)胞中的重金屬離子形成螯合物，降低自由離子對(duì)細(xì)胞的生物毒性.PCs最早是從鎘離子誘導(dǎo)的蛇根木(Rauvolfiaserpentina)懸浮細(xì)胞中提取到的鎘結(jié)合多肽.PCs與源于動(dòng)物的金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)(同樣富含半胱氨酸)的差異在于PCs不是基因的產(chǎn)物，而是以谷胱甘肽(glutathione，GSH)為前體催化合成.GSH在重金屬毒害中具有雙重作用，既是一種重要的抗氧化劑，又是PCs合成的直接前體，而PCs清除H2O2的能力是GSH的5～6倍[4].這些螯合劑通常存在于細(xì)胞質(zhì)中，是植物應(yīng)對(duì)重金屬脅迫的重要機(jī)制.
土壤重金屬元素有Cd、Cu、Hg、As、Cr、Pb等，離子種類對(duì)不同螯合劑的誘導(dǎo)程度存在很大差異.Cu2+、Cd2+均帶有二價(jià)正電荷，雖然不是伴生金屬，但二者均是土壤中最為常見的污染元素.污染土壤中的金屬離子常以復(fù)合脅迫的形式存在，其相互作用(表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)、疊加效應(yīng)或協(xié)同效應(yīng))直接影響植物對(duì)金屬離子的累積和不同層次上的生物毒性[5]，這種互作在理化性質(zhì)相似的離子之間更為顯著[6].一氧化氮(NO)作為一種信號(hào)分子，參與多種重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)制，在植物重金屬解毒機(jī)制中起重要作用[7-8].番茄(Solanumlycopersicum)是廣受人們喜愛的蔬菜，在城市郊區(qū)及設(shè)施栽培等重金屬污染較重的區(qū)域普遍栽培.本研究以番茄為試驗(yàn)材料，采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，探索外源NO緩解番茄Cu、Cd脅迫的機(jī)制，為揭示Cu、Cd互作及復(fù)合重金屬脅迫的解毒機(jī)理提供理論依據(jù).
1材料與方法
1.1供試材料
供試番茄品種為“改良毛粉802F1”，購(gòu)自登海五岳泰山種業(yè)有限公司.Hoagland改良營(yíng)養(yǎng)液組成為Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、EDTA-Na、微量元素，以上試劑均為分析純，用蒸餾水配置.NO供體為硝普鈉([Na2Fe(CN)5]NO，SNP)，購(gòu)自Sigma公司，Cu2+、Cd2+分別由CuCl2、CdCl2提供，先用蒸餾水配成200μmol·L-1的母液，4℃避光保存，用時(shí)按所需濃度稀釋.
1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)
試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)智能溫室栽培床上實(shí)施，種子經(jīng)55℃溫湯浸種消毒15min，然后在潤(rùn)濕的吸水紙上28℃催芽.待種子露白后，播于洗凈的細(xì)砂中，于育苗盤中培養(yǎng)，出苗后用1/4Hoagland改良營(yíng)養(yǎng)液澆灌.當(dāng)幼苗長(zhǎng)出3～4片真葉時(shí)，挑選生長(zhǎng)一致的植株洗凈根部細(xì)砂，移栽于盛有1/2Hoagland改良營(yíng)養(yǎng)液的塑料桶(5.0L)培養(yǎng)，每桶定植5株.預(yù)培養(yǎng)1周，換成完全營(yíng)養(yǎng)液.每3d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，低濃度KOH或HCl調(diào)節(jié)pH至(5±0.2).營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)期間用電動(dòng)氣泵24h連續(xù)通氣.
當(dāng)植株長(zhǎng)至5～6片真葉時(shí)，對(duì)番茄幼苗進(jìn)行脅迫處理.試驗(yàn)設(shè)置7個(gè)處理:1)完全營(yíng)養(yǎng)液(對(duì)照，CK);2)50μmol·L-1CuCl2，Cu脅迫處理(Cu);3)50μmol·L-1CuCl2+100μmol·L-1SNP，NO緩解處理(Cu+S);4)50μmol·L-1CdCl2，Cd脅迫處理(Cd);5)50μmol·L-1CdCl2+100μmol·L-1SNP，NO緩解處理(Cd+S);6)50μmol·L-1CuCl2+50μmol·L-1CdCl2，Cu和Cd脅迫處理(Cu+Cd);7)50μmol·L-1CuCl2+50μmol·L-1CdCl2+200μmol·L-1SNP，NO緩解處理(Cu+Cd+S).每處理重復(fù)3次，隨機(jī)排列.處理8d后收獲植株根系及葉片.部分鮮樣用于測(cè)定酶活性，部分樣品液氮速凍，-80℃貯存?zhèn)溆?
1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法
1.3.1植物亞細(xì)胞組的分離及各亞細(xì)胞組分Cu、Cd含量測(cè)定采用離心法對(duì)番茄根系亞細(xì)胞組分(細(xì)胞壁、細(xì)胞器及細(xì)胞可溶性組分)進(jìn)行分離[9].并將分離的各組分分別轉(zhuǎn)移至三角瓶，電熱板蒸干，再加入5mL濃硝酸消煮，50mL容量瓶定容，原子吸收分光光度計(jì)(島津AA3700)測(cè)定Cu、Cd.
1.3.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)和谷胱甘肽合成酶(GS)活性測(cè)定γ-ECS活性采用試劑盒(購(gòu)自南京建成)測(cè)定;GS活性采用試劑盒(購(gòu)自江萊生物)測(cè)定.
1.3.3植物螯合肽、谷胱甘肽及金屬硫蛋白(MTs)含量測(cè)定PCs測(cè)定采用差減法[10]，公式為:PCs=(TNP-SH)-(GSH-GSSG).非蛋白質(zhì)態(tài)巰基總量(TNP-SH)含量測(cè)定利用Ellman試劑進(jìn)行定量[11].還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的測(cè)定參照郝建軍等[12]的方法;MT含量測(cè)定采用銀飽和分析法[13].
1.4數(shù)據(jù)處理采用MicrosoftExcel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及繪圖，采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件的Duncan極差法對(duì)平均數(shù)進(jìn)行多重比較(α=0.05).
期刊推薦：《應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)》是中國(guó)科學(xué)院主管、中國(guó)生態(tài)學(xué)學(xué)會(huì)和中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所聯(lián)合主辦的綜合性學(xué)術(shù)期刊，創(chuàng)刊于1990年，由科學(xué)出版社出版。內(nèi)容主要包括：森林生態(tài)學(xué)、農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)、草地生態(tài)學(xué)、漁業(yè)生態(tài)學(xué)、海洋與濕地生態(tài)學(xué)、資源生態(tài)學(xué)、景觀生態(tài)學(xué)、全球變化生態(tài)學(xué)、城市生態(tài)學(xué)、產(chǎn)業(yè)生態(tài)學(xué)、生態(tài)規(guī)劃與生態(tài)設(shè)計(jì)、污染生態(tài)學(xué)、化學(xué)生態(tài)學(xué)、恢復(fù)生態(tài)學(xué)、生態(tài)工程學(xué)、生物入侵與生物多樣性保護(hù)生態(tài)學(xué)、流行病生態(tài)學(xué)、旅游生態(tài)學(xué)和生態(tài)系統(tǒng)管理等。讀者對(duì)象主要：從事生態(tài)學(xué)、地學(xué)、林學(xué)、農(nóng)學(xué)和環(huán)境科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)的科技工作者，有關(guān)專業(yè)學(xué)生及經(jīng)濟(jì)管理和決策部門的工作者。有投稿需求的作者，可以直接與期刊天空在線編輯聯(lián)系。
2結(jié)果與分析
2.1外源NO對(duì)不同Cu、Cd脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)的影響由表1可知，50μmol·L-1Cu、Cd單一脅迫和復(fù)合脅迫均使番茄生物量顯著降低，其中Cd的毒害效應(yīng)顯著高于Cu.與對(duì)照相比，Cd處理下番茄地上部和根系的生物量降幅均最大(分別為50.3%、48.1%).Cu+Cd復(fù)合脅迫下，番茄地上部與根系生物量分別比對(duì)照降低30.8%和18.7%，但與單一脅迫相比，復(fù)合脅迫地上部生物量較Cu單一脅迫降低13.4%，較Cd單一脅迫反而增加28.2%，差異顯著.外源NO對(duì)Cd單一脅迫下番茄地上部和根系生表1外源NO對(duì)不同Cu、Cd脅迫下番茄幼苗生長(zhǎng)的影響Table1EffectsofexogenousNOonthegrowthoftomatoseedlingsunderdifferentCu，Cdstress處理Treatment地上部鮮質(zhì)量Shootfreshmass(g·plant-1)根系鮮質(zhì)量Rootfreshmass(g·plant-1)株高Shootheight(cm·plant-1)CK32.52±0.76a9.53±0.71a35.70±0.41aCu25.97±0.28b6.95±1.57b33.30±0.23aCu+SNP29.80±0.23a7.70±0.77b34.47±0.54aCd16.15±0.44d4.95±0.67c12.00±0.95bCd+SNP21.40±0.12c7.25±0.46b36.43±0.55aCu+Cd22.50±0.47c6.85±0.45b29.58±0.81aCu+Cd+SNP20.10±0.032c7.82±0.52b31.23±0.57a不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)Differentsmalllettersmeantsignificantdifferenceamongtreatmentsat0.05level.下同Thesamebelow.物量的抑制緩解效應(yīng)最顯著，而對(duì)Cu單一脅迫和Cu+Cd復(fù)合脅迫下番茄地上部和根系生物量的抑制緩解效應(yīng)不明顯.與對(duì)照相比，不同Cu、Cd脅迫處理均降低番茄株高，其中Cd單一脅迫處理降幅最顯著(達(dá)67.1%).外源NO一定程度上可緩解Cu、Cd脅迫對(duì)番茄莖伸長(zhǎng)的抑制作用，Cd單一脅迫下添加NO番茄株高恢復(fù)最為明顯(為Cd脅迫的3倍)，株高甚至超過(guò)對(duì)照.而Cu單一脅迫和Cu+Cd復(fù)合脅迫下添加外源NO對(duì)株高的影響均不顯著.
2.2外源NO對(duì)Cu、Cd脅迫下番茄根系Cu、Cd亞細(xì)胞分布的影響
由表2可知，正常營(yíng)養(yǎng)條件下，Cu較為均勻地分布在根系亞細(xì)胞的各個(gè)組分.與對(duì)照相比，Cu單一脅迫和Cu+Cd復(fù)合脅迫下細(xì)胞壁、細(xì)胞器、可溶性組分Cu含量均顯著增加.Cu單一脅迫下各部位Cu含量分別為對(duì)照的5.53、2.75和9.35倍，而復(fù)合脅迫下各部位含量分別為對(duì)照的4.64、6.25和10.33倍.可見，進(jìn)入細(xì)胞的Cu呈急劇增加的趨勢(shì)，尤其是各細(xì)胞器組分的增幅最大.不同Cu、Cd脅迫處理下，可溶性組分的Cu濃度均最高.添加外源NO后，Cu單一脅迫下的番茄根系細(xì)胞器和可溶性部分Cu含量分別下降33.3%和9.3%，差異顯著，但未恢復(fù)至對(duì)照水平;Cd單一脅迫下各亞細(xì)胞組分亦不同程度降低，細(xì)胞器中Cu降幅最大(75.2%)，其次是細(xì)胞壁(31.9%);Cu+Cd復(fù)合脅迫下添加外源NO使細(xì)胞壁和可溶性部分Cu含量繼續(xù)升高，而細(xì)胞器中則降低8.6%.
與對(duì)照相比，Cd單一脅迫處理的細(xì)胞壁和細(xì)胞器中Cu含量分別降低12.2%和3.1%，可溶性部分有增加的趨勢(shì)(5.9%)，說(shuō)明正常營(yíng)養(yǎng)條件下添加過(guò)量Cd2+，可部分取代細(xì)胞器及組織上的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)有限的Cu2+轉(zhuǎn)向可溶性組分，但差異并不顯著.Cd單一脅迫和Cu+Cd復(fù)合脅迫下，過(guò)多的Cd更多分布于細(xì)胞可溶性組分，Cu+Cd復(fù)合脅迫下，細(xì)胞器和可溶性組分Cd含量比Cd單一脅迫高出84.9%和37.2%，表明Cd脅迫下添加Cu有促進(jìn)Cd吸收的趨勢(shì).添加外源NO后，Cd單一脅迫亞細(xì)胞各組分Cd含量繼續(xù)升高，細(xì)胞壁、細(xì)胞器和可溶性組分分別升高27.3%、38.5%和57.9%.Cu+Cd復(fù)合脅迫處理在添加外源NO后各部位Cd含量亦有升高的趨勢(shì)，但只有可溶性組分增幅顯著(達(dá)22.3%)
以上分析顯示，外源NO對(duì)Cd脅迫下Cu、Cd吸收的調(diào)控幅度普遍大于Cu脅迫.無(wú)論是Cu單一脅迫還是Cd單一脅迫，外源NO對(duì)Cu的吸收呈現(xiàn)抑制的趨勢(shì);不管是Cd單一脅迫還是Cu+Cd復(fù)合脅迫，外源NO對(duì)Cd的吸收呈現(xiàn)促進(jìn)的趨勢(shì).
2.3外源NO對(duì)Cu、Cd脅迫下番茄γ-ECS和GS活性的影響
由圖1可知，不同Cu、Cd脅迫處理在一定程度上可使番茄根系和葉片γ-ECS活性顯著提高，且Cu和Cd單一脅迫下葉片的γ-ECS活性普遍高于根系.與對(duì)照相比，Cu+Cd復(fù)合脅迫下根系γ-ECS活性達(dá)到最高，比Cu、Cd單一脅迫分別提高120.1%和41.5%;葉片中γ-ECS活性的變化趨勢(shì)與根系相反，復(fù)合脅迫分別比Cu、Cd單一脅迫降低8.3%和24.4%.無(wú)論根系還是葉片，Cu單一脅迫在添加外源NO后，γ-ECS活性均顯著提高(分別恢復(fù)65.6%和12.6%).Cu+Cd復(fù)合脅迫下添加外源NO后γ-ECS活性的變化趨勢(shì)與Cd單一脅迫相近，根系和葉片γ-ECS活性分別降低12.1%和28.5%.
與對(duì)照相比，不同Cu、Cd脅迫處理均顯著提高番茄GS活性，其中Cu+Cd復(fù)合脅迫比Cu、Cd單一脅迫GS活性高，根系和葉片分別比對(duì)照提高57.6%和65.1%，比Cu單一脅迫提高39.5%和42.2%，比Cd單一脅迫提高40.5%和68.4%.添加外源NO對(duì)不同Cu、Cd單一脅迫和復(fù)合脅迫下GS活性均有促進(jìn)作用，其中根系GS活性增幅較大，分別比未施NO處理增加73.1%、59.3%和45.4%.
2.4外源NO對(duì)Cu、Cd脅迫下番茄GSH和GSSG含量及GSH/GSSG的影響
由圖2可以看出，番茄根系中，Cd單一脅迫下GSH含量比對(duì)照提高10.8%，而Cu單一脅迫和Cu+Cd復(fù)合脅迫下，GSH含量分別降低12.6%和37.9%，差異顯著.添加外源NO對(duì)根系Cu、Cd單一脅迫下的GSH含量影響不顯著，但顯著提高復(fù)合脅迫下根系GSH含量(提高80%).葉片中，Cu單一脅迫GSH含量大幅下降，Cd單一脅迫和Cu+Cd復(fù)合脅迫GSH含量無(wú)顯著變化，但添加外源NO后，Cu、Cd單一脅迫葉片GSH含量急劇上升，分別增至脅迫處理的3.0和1.5倍，超出了對(duì)照.而Cu+Cd復(fù)合脅迫下添加外源NO后，葉片GSH含量則減少至原來(lái)的54.3%，與根系GSH含量驟升的趨勢(shì)相反.
與對(duì)照相比，根系中，Cu單一脅迫下GSSG含量顯著上升，添加NO后GSSG含量反而下降.Cd單一脅迫下，番茄GSSG含量有所降低，添加NO后有所回升，但差異均不顯著;與對(duì)照相比，Cu+Cd復(fù)合脅迫GSSG顯著降低，添加外源NO后繼續(xù)下降;葉片中，Cu單一脅迫的GSSG升高至對(duì)照的2.1倍，添加外源NO后GSSG含量回落至對(duì)照水平.Cd單一脅迫下，葉片GSSG含量有所降低，添加外源NO后顯著回升，甚至高于對(duì)照，而Cu+Cd復(fù)合脅迫下添加外源NO后葉片GSSG含量亦顯著回升(增加86.9%).根系和葉片GSSG、GSH含量變化對(duì)NO的響應(yīng)呈現(xiàn)互為消長(zhǎng)的趨勢(shì)，說(shuō)明Cu、Cd脅迫誘導(dǎo)GSH/GSSG的氧化還原過(guò)程.
