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摘 要： 摘要: 倉儲生態因子和煙葉化學成分的改變直接影響煙葉微生物群落結構和功能。以儲存在貴陽庫( GY) 、壇廠庫( TC) 及紫云庫( ZY) 的云南保山 C3F 煙葉為研究對象，對不同陳化時間( 0、6、12、18、24 個月) 的煙葉樣品提取微生物總 DNA，利用 Illumina HiSeq
摘要: 倉儲生態因子和煙葉化學成分的改變直接影響煙葉微生物群落結構和功能。以儲存在貴陽庫( GY) 、壇廠庫( TC) 及紫云庫( ZY) 的云南保山 C3F 煙葉為研究對象，對不同陳化時間( 0、6、12、18、24 個月) 的煙葉樣品提取微生物總 DNA，利用 Illumina HiSeq 平臺對細菌的 16S rRNA V4 區進行高通量測序，并結合主要化學成分分析，以期揭示煙葉陳化過程中細菌群落演替規律及其與煙葉化學成分間的作用關系。研究結果表明，煙葉細菌群落以假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養單胞菌屬、芽孢桿菌屬為優勢屬; 隨陳化時間的增加，細菌優勢群落呈現出變形菌門和厚壁菌門間消長變化的趨勢，陳化后期芽孢桿菌( 厚壁菌門) 優勢度明顯增強; 煙葉陳化過程中，細菌優勢功能群變化與化學成分逐級降解間呈顯著的相關關系，主要表現為由降解糖類菌群向降解淀粉類菌群，再向降解纖維素類菌群變化的趨勢; 其中，影響菌群演替的關鍵因素是水溶性總糖和纖維素。研究結果揭示了在煙葉陳化過程中存在顯著的細菌群落演替特征，加深了對煙葉陳化機制的理解，為微生物調控煙葉陳化過程提供了科學依據。
關鍵詞: 高通量分析; 群落結構; 演替規律; 化學組分
煙葉陳化是指在人工可控的倉儲環境下煙葉與微生物及環境相互作用的發酵過程，在此過程中，倉儲環境因子( 溫度、濕度等) 、煙葉化學組分( 總糖、蛋白質、淀粉、生物酶等) 含量、煙葉水分及酸堿度等與煙葉表面微生物彼此聯系、互相促進、互相制約共同構成了煙葉陳化的特定生態系統，并在物質流、能量流和基因流 “三流運轉”規律的交互作用下構成了煙葉微生態的動態發展和特定階段的動態平衡[1]。環境信息的傳遞和煙葉化學物質的改變直接或間接的影響著煙葉微生物的種類和數量及代謝產物的產生與積累，并最終決定著物質和能量的走向[2-3]，因此，研究倉儲生態因子和煙葉化學成分的改變對煙葉微生物群落結構和功能的影響具有重要意義。隨著煙葉陳化的不斷進行，微生物群落的消長演替又會引起煙葉組分微環境的變化[4]，如蛋白質、淀粉、糖類、纖維素等大分子物質降解[5-6]及紫羅蘭酮、大馬酮、糠醛等小分子物質產生[7-8]。環境因子變化也會作用于微生物，并導致群落結構及代謝產物的成分和比例發生變化，最終形成產品特有的生態風味[9]，所以，研究微生物群落動態變化對了解煙葉陳化生態系統的運行很有必要。
煙葉陳化過程中占優勢的微生物群落以細菌類為主[10]，但是目前 90%—99%的微生物處于不可培養狀態[11]，因此本研究依托二代測序的技術優勢[12]對樣品中微生物菌群進行分析，同時結合分析陳化過程中煙葉化學組分的變化，揭示細菌群落變化過程與煙葉化學組分之間作用規律，加深對煙葉陳化機制的理解。
1 材料與方法
1.1 材料
樣品: 分別陳化了 0、6、12、18、24 個月的云南保山 C3F 煙葉樣品( 產地: 云南保山地區; 品種: 云 87; 等級: C3F) ; 采集地: 貴陽庫( GY) 、壇廠庫( TC) 、紫云庫( ZY) ; 采集方式: 除去煙箱表層煙葉，按五點式收集煙葉樣品，500g，存于-20℃ 冰箱中，各庫樣品同一時間內采集; 采集時間: 2014 年 7 月、2015 年 1 月、2015 年 7 月、 2016 年 1 月、2016 年 7 月; 編號: GY-0、TC-0、ZY-0、GY-6、TC-6、ZY-6、GY-12、TC-12、ZY-12、GY-18、TC-18、ZY- 18、GY-24、TC-24、ZY-24。
1.2 方法
1.2.1 煙葉微生物收集與總 DNA 提取
參照 Zhao 等[13]和 Su 等[14]的網膜法收集煙葉總微生物。稱取 60g 煙葉樣品，剪碎，平均分成 3 份，分別置于 3 個裝有 200mL pH = 7.0 磷酸緩沖溶液( PBS) 的三角瓶中，27℃、200r /min 震蕩培養 1h; 用已滅菌的雙層紗布過濾培養物，收集濾液; 6000r /min 室溫離心 30min，收集沉淀; 加入 20mL PBS 緩沖液，重新制成菌懸液， 6000r /min 離心，收集沉淀，最后將相同樣品的沉淀物匯集到一起，即為煙葉總微生物。參照 OMEGA 公司 E. Z.N.A. SoiL DNA Kit 試劑盒說明方法提取微生物總 DNA。提取的總 DNA 送北京諾和致源科技股份有限公司進行高通量測序。
1.2.2 PCR 擴增及高通量測序
選取 16S rRNA 基因 V4 片段進行 PCR 擴增，擴增產物使用 HiSeq2500 PE250 進行上機測序。選用引物: 515F( 5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') 和 806R( 5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 。反應體系( 30μL) : Phusion Master Mix( 2×) 15μL; Primer1( 2μmol /L) 1.5μL; Primer2( 2μmol /L) 1.5μL; DNA 模板( 1ng /μL) 10μL; H2O 2μL。反應程序: 98℃預變性 1min; 98℃ 10s，50℃ 30s，72℃ 5min，共 30 個循環; 72℃延伸 5min。
1.2.3 化學物質檢測
參照李永忠等[15]方法進行煙葉常規化學物質檢測，每個樣品設置 3 個重復。有機碳采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化容量法; 全氮采用H2 SO4-H2O2消化-蒸餾法; 全磷采用 H2 SO4-H2O2消化-鉬黃比色法; 全鉀采用 H2 SO4-H2O2消化-火焰分光光度法; 水溶性總糖采用 80%酒精浸提-蒽酮比色法; 煙堿采用堿蒸餾-紫外分光光度法; 淀粉采用稀酸水解-蒽酮比色法; 蛋白質采用凱氏定氮法; 粗纖維采用酸堿洗滌-重量法; 石油醚浸提物采用石油醚浸提-重量法。
1.2.4 數據處理
①序列處理及 OTU 注釋: 根據 Barcode 序列和 PCR 擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣品數據，截去 Barcode 和引物序列后使用 FLASH[16]對每個樣品的 Reads 進行拼接，得到原始 Tags 數據; 參照 Qiime[17]的 Tags 質量控制流程，經過 Tags 截取、過濾及嵌合體去除等處理后得到高質量的有效 Tags 數據。利用 Uparse 軟件，以 97%的一致性將序列聚類為 OTUs( Operational Taxonomic Units) ，選取 OTUs 的代表性序列用 Mothur 方法與 SSU rRNA 數據庫對 OTUs 進行物種注釋，并在 OTU 水平上進行 α 多樣性分析。
②細菌群落動態變化分析: 通過韋恩圖分析陳化不同時間的樣品 OTUs 分布差異; 根據所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前 35 的類群，從物種和樣品兩個層面進行聚類，繪制成熱圖，分析不同陳化時間樣品優勢細菌類群變化情況; 通過 LEfSe 系統分析不同陳化時間的樣品間顯著差異的物種。
③細菌群落變化與化學成分關系分析: 結合不同陳化時間優勢細菌及關鍵類群，利用 SPSS 19. 0、 CANOCO 5等統計學軟件對細菌群落與各化學指標進行相關性分析和冗余分析( RDA) 。
2 結果與分析
2.1 高通量測序結果
Shannon-Winner 指數曲線可反映各樣本的物種多樣性隨測序量的變化情況[18]。如圖 1 所示，隨著樣品序列數的增加，Shannon-Winner 指數曲線越趨向平坦，表明本試驗測序的數據深度能較全面地反應測序樣品中微生物信息。
樣品 DNA 高通量測序結果如表 1 所示，經拼接、優化、過 濾 后 得 到 1191887 條 有 效 序 列，每 個 樣 品 得 67940—86235 條; 以 97%的一致性將序列聚類，平均得到 1099 個 OTU。對不同樣品的 α 多樣性指數進行對比分析發現，樣品細菌豐富度的 Chao1 指數和 ACE 指數分別在 510. 34—3528. 94 和 520. 33—2226. 74 之間。反映菌 群 多 樣 性 的 Shannon 和 Simpson 值 分 別 達 到 3.47—6.59 和 0.70—0.96。其中，樣品 GY-0 細菌最豐富，多樣性最大，Shannon 指數達 6.59，樣品 ZY-18 多樣性最低，Shannon 指數為 3.47; 樣品 GY-24 和 TC-0 均勻性最好，Simpson 指數均達到 0.97，ZY-18 均勻性最差，Simpson 指數為 0.70。所有樣品 Coverage 指數均達到 0.98以上，表明本次研究所測得的數據足夠反應煙葉細菌群落的多樣性。
2.2 細菌群落組成
煙葉細菌種類豐富，分屬于 493 個屬，每個樣品相對豐度大于 1.0%的類群組成，如圖 2 所示( < 1.0%的歸于 Others) 。假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養單胞菌屬、芽孢桿菌屬為主要優勢類群，其中，假單胞菌屬占主導優勢，占 17.8%—44.3%，其次是鞘氨醇單胞菌屬，占 8.0%—23.6%。
2.3 不同陳化時間煙葉細菌群落動態演替分析
2.3.1 OTU 變化分析
在 OTU 水平上繪制韋恩圖，如圖 3 所示。貴陽庫( 圖 3A) 樣品有 313 個共有 OTUs，陳化 0、6、12、18、24 個月時分別有 267、110、90、120、159 個特有 OTUs。壇廠庫( 圖 3B) 樣品有 170 個共有 OTUs，陳化 0、6、12、18、24 個月時分別有 249、82、126、115、262 個特有 OTUs。紫云庫( 圖 3C) 樣品有 176 個共有 OTUs，陳化 0、6、12、18、 24 個月時分別有 192、97、140、41、264 個特有 OTUs。共有的 OTUs 表明這些細菌類群的作用在煙葉陳化過程中貫穿于陳化的始終，是煙葉陳化的主要細菌類群; 不同陳化階段特有 OTUs 表明煙葉陳化過程中功能細菌群落與陳化進程密切相關，演替現象明顯。
2.3.2 優勢細菌類群變化分析
針對陳化不同時間對所有樣品進行組合分析，發現煙葉細菌群落結構隨陳化時間的延長發生了較大變化 ( 圖 4 ) 。 陳化開始時擬桿菌門的 Sphingobacterium，變 形 菌 門 的 Steroidobacter、Aquicella、Legionella、 Pseudoxanthomonas、Methylobacterium 及 厚 壁 菌 門 的 Romboutsia 等 類 群 占 優 勢。6 個月時變形菌門的 Pusillimonas 和 Vulgatibacter 占優勢。12 個月時綠彎菌門的 unidentified_Anaerolineaceae 占優勢。18 個月時，所有類群的豐度都相對較低，變形菌門的 Pusillimonas 占優勢。24 個月時，變形菌門的 Stenotrophomonas 和 Comamonas，厚壁菌門的 Solibacillus、Bacillus、Staphylococcus、Paenibacillus 及放線菌門的 Kocuria 等類群優勢明顯。
整體來看，隨著煙葉陳化時間的增加，細菌優勢類群種類先減少后增加，其中變形菌類逐漸減少，厚壁菌類和放線菌類逐漸增加，這種變化與李曉強研究結果相似[19]。
2.3.3 關鍵細菌類群變化分析
通過 LEfSe 分析( LDA 值默認為 4) 發現，在煙葉陳化 0、12、24 個月時樣品之間具有顯著差異的細菌類群，結果如圖 5 所示。陳化開始時 Methylobacterium 差異顯著，起重要作用。陳化 12 個月時 Enterobacteriaceae起重要作用。陳化 24 個月時 Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas 差異明顯，發揮重要作用。 LEfSe 分析表明隨煙葉陳化時間延長，關鍵優勢菌群發生一系列演變，先 是 由 Methylobacterium 向 Enterobacteriaceae 演變，隨后向 Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas 變化。其中，Methylobacterium、 Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas、Enterobacteriaceae 均屬于變形菌門類群，Bacillus 屬于厚壁菌門類群，因此，隨陳化時間延長，厚壁菌門優勢逐漸增加，芽孢桿菌優勢度后期明顯增強。
2.4 細菌群落演替與煙葉化學成分的關系
RDA 分析結果中，軸 1 和軸 2 累積變量分別為 50.70%和 73.24%，化學物質變化對細菌群落演替整體解釋量為 78.90%。據圖 6 和表 2 可知，水溶性總糖對細菌群落動態影響最大，其次是纖維素。陳化開始時 ( Ⅰ) ，水溶性總糖貢獻最大，與 Pusillimonas 顯著負相關，相關系數為- 0. 546，與 Steroidobacter、Romboutsia、 Clostridium_sensu_stricto_1、Legionella 顯著正相關，相關系數分別為 0.613、0.613、0.656、0.517。陳化 12 個月時 ( Ⅱ) ，淀粉、石油醚浸提物及總氮、總磷等影響最大，石油醚浸提物與 Xanthomonas 呈顯著負相關，相關系數為-0.541，與 Pusillimonas、Vulgatibacter 呈顯著正相關，相關系數為 0.579、0.524; 總磷與 Xanthomonas 呈顯著負相關，相關系數為-0.528。陳化 24 個月時( Ⅲ) ，纖維素作用最明顯，與 Staphylococcus、Aureimonas、Massilia 呈顯著正相關，相關系數為 0.562、0.539、0.528。隨著時間的延長，細菌群落發生了由降解糖類向降解淀粉類菌群變化，再向降解纖維素類菌群變化的演替現象，這與化合物的逐級降解相關。
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