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摘 要： 摘要：【背景】鄂爾多斯地區傳統自然發酵苦菜風味和作用獨特，但目前尚無關于發酵苦菜中乳酸菌種類及其生物學特性研究的報道。【目的】獲得適用于工業化生產特性優良的乳酸菌。【方法】通過測定總酸度篩選高產酸菌株，并進行形態學鑒定、生理生化特性研究，
摘要：【背景】鄂爾多斯地區傳統自然發酵苦菜風味和作用獨特，但目前尚無關于發酵苦菜中乳酸菌種類及其生物學特性研究的報道。【目的】獲得適用于工業化生產特性優良的乳酸菌。【方法】通過測定總酸度篩選高產酸菌株，并進行形態學鑒定、生理生化特性研究，以及16SrRNA基因片段分析。【結果】經鑒定5株高產酸的菌株均為植物乳桿菌，生長溫度范圍寬，并且具有耐酸、耐堿、耐鹽、耐熱的特性。【結論】試驗菌株具有優良的生理特性和潛在的益生特性，可用于食品工業的生產。
關鍵詞：發酵苦菜，乳酸菌，高產酸，鑒定，生理生化特性
苦菜是菊科苦荬菜屬草本植物，在我國分布廣泛，具有清熱解毒、消炎抑菌、提高免疫力等食藥用功效[1]。在內蒙古中西部及山西的許多地域，民間流傳著食用苦菜的習俗，而且在鄂爾多斯地區農牧民在夏季將苦菜通過微生物作用酸漬保藏，可一直食用到冬季。這種發酵苦菜除了苦菜本身的作用，細菌的作用如何、細菌與苦菜的關系如何?在以苦菜為主料基質中的乳酸菌又有什么特殊性?這些問題一直備受研究者關注。但目前國內尚未有針對自然發酵苦菜中優勢菌的分離及特性研究的報道。有研究報道自然酸漬蔬菜中的優勢菌為乳酸菌，它具有抑制腸道病原菌、調節腸道菌群平衡等益生特性[2-3]。針對乳酸菌酸漬菜而言，乳酸菌的產酸量以及產酸條件直接影響酸漬產品的品質和生產，所以高產酸乳酸菌的篩選以及特性研究對乳酸菌在酸漬蔬菜中的應用有重要意義。鑒于此，本研究從鄂爾多斯市白泥井鎮地區農戶自然發酵腌制的苦菜汁中篩選出5株高產酸的乳酸菌，并對其進行了鑒定和生理特性的研究，這將為發酵蔬菜提供優良菌種資源，并且為發酵蔬菜的工業化生產提供試驗數據，也為當地特色發酵食品有益作用的進一步研究提供理論依據。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1樣品
采集自內蒙古鄂爾多斯市達拉特旗白泥井鎮地區5戶農戶家中的夏季腌制苦菜湯，共9個樣品。
1.1.2標準菌株
植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC6238，代號為ZB，來自中國工業微生物菌種保藏管理中心。
1.1.3培養基、主要試劑及儀器
TPY、MRS、GYP培養基及產酸菌株篩選培養基等均按照參考文獻[4-6]的方法配制。所用試劑均為分析純，購于天津市風船化學試劑科技有限公司;生化特性鑒定及糖發酵試驗所用試劑均購于廣東環凱微生物科技有限公司和杭州濱和微生物試劑有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)購于北京天根生物科技有限公司;DNAmarkerDL2000、6×Loadingbuffer和2×EasyTaqSuperMix購于TaKaRa生物工程(大連)有限公司。
紫外可見分光光度計，上海美普達儀器有限公司;生化培養箱，上海恒科技有限公司;電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學儀器廠;電泳儀，北京百晶生物技術有限公司;光學顯微鏡，Olympus公司;PCR儀，AppliedBiosystems公司。
1.2方法
1.2.1酸性樣品乳酸菌的分離與純化
將酸苦菜湯樣品分別接種到TPY培養基中，37°C培養24h，將一代菌液接種到MRS液體培養基中，37°C培養24h，得到的第2代菌液繼續接入MRS液體培養基，37°C培養24h得到活性較高的第3代菌液。將第3代菌液在產酸菌株篩選培養基上進行劃線分離，在37°C、7%CO2濃度條件下厭氧培養24−48h，挑取有明顯溶鈣圈的菌落，然后在MRS平板上繼續劃線分離純化，挑選革蘭氏染色陽性、H2O2酶陰性、無芽孢符合乳酸菌特征的單菌落，并油鏡鏡檢、保存，以備篩選、鑒定使用。
1.2.2供試菌液的制備
將保存的菌株活化3代，第3代菌液3000r/min離心10min，棄去上清液，收集菌體加入等量的無菌生理鹽水洗滌3次后，加入等量無菌生理鹽水混勻，待用。
1.2.3高產酸菌株的篩選
將保存的菌株活化3代，按1.2.2所示的方法制備供試菌液并接種到100mL的MRS液體培養基中，37°C培養72h取發酵液lmL置于三角瓶中，用50mL蒸餾水稀釋，滴加2滴0.1%酚酞為指示劑，用0.1mol/L的NaOH標準溶液滴定溶液至微紅色，記錄消耗的NaOH標準溶液體積，每個菌株平行測定3次，酸度以100mL發酵液中的產酸量計[7]。
1.2.4高產酸菌株的特性試驗
(1)乳酸定性試驗：對篩選出的高產酸菌株進行薄層層析實驗，以2%的乳酸標準溶液作為對照。展開劑為水:苯甲醇:正丁醇=1:5:5(體積比)，并加入1%的甲酸。以0.04%的溴甲酚紫酒精溶液為顯色劑，待層析液揮發之后，向層析板噴灑并計算Rf值[8]。
(2)形態特征觀察：將篩選到的高產酸菌株接種到MRS固體培養基，37°C培養24h，觀察菌落特征，挑取典型單菌落，涂片進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察菌體的形態。
(3)生化特性試驗：按照參考文獻[4-5,9]進行H2O2酶試驗、硫化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、尿素酶試驗、V-P試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、糖發酵試驗、運動性檢查、葡萄糖產氣試驗。以上試驗均使用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC6238作為對照。
(4)16SrRNA基因片段序列分析：將活化好的3代菌液，按試劑盒說明提取各試驗菌株的全基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA純度。PCR擴增的引物為27F(5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)ʹ和1495R(5ʹ-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)ʹ，擴增片段長約1500bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系(50μL)：模板DNA2μL，上、下游引物(10μmol/L)各2μL，2×EasyTaqSuperMix25μL，ddH2O補足至50μL。PCR反應條件：94°C3min;94°C30s，65°C30s，72°C1min，共35個循環;72°C5min。PCR擴增產物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。
1.2.5生理特性研究
(1)生長曲線的測定：將菌株按2%的接種量接種于MRS液體培養基中37°C培養，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32、40、48、60、72h取樣測定OD600值;在0、2、4、8、12、16、20、24、28、32、40、48、60、72h取樣測定活菌數，繪制生長曲線。
(2)耐鹽試驗：將菌株分別接種于NaCl濃度為0、2%、6%、10%(質量體積比)的MRS液體培養基中，37°C培養24h，測定OD600值。
(3)pH試驗：將菌株分別接種于pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、9.0的MRS液體培養基中，37°C培養24h，測定OD600值。
(4)溫度試驗：將菌株接種于MRS液體培養基中，分別在15、25、45°C培養24h，測定OD600值。
(5)耐熱試驗：將菌株接種于MRS液體培養基中，放置于60°C水浴鍋加熱處理30min，37°C培養24h，測定OD600值。以上試驗均以不接菌的空白MRS培養基為對照。
2結果與分析
2.1酸性苦菜樣中乳酸菌的分離
從9個發酵苦菜樣品中分離得到了18株符合乳酸菌特性的菌，編號分別為1-1、1-2、2-11、2-17、3-1、3-2、3-3、5-3、5-4、6-5、6-6、7-1、7-4、7-5、7-9、9-3、9-5、9-8。
2.2高產酸菌株的篩選結果
測定18株菌的最終發酵酸度結果如圖1所示，在相同培養條件下，各菌株最終發酵酸度不同，篩選出5-4、7-5、1-2、1-1、6-6這5株產酸量較高的菌，其中5-4的酸度為2.479×10−2mol，7-5的酸度為2.447×10−2mol，1-2的酸度為2.436×10−2mol，1-1的酸度為2.424×10−2mol，6-6的酸度為2.427×10−2mol，而空白培養基的酸度為0.530×10−2mol，5株菌均比空白培養基的酸度提高近5倍，將所有平行測定的數據進行顯著性分析，差異性顯著(P<0.05)。
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2.3高產酸菌株鑒定結果
2.3.1乳酸薄層層析定性結果
乳酸薄層層析定性實驗結果為樣品的斑點與乳酸標準品的斑點處于同一位置，測定乳酸標準溶液和篩選出的5株乳酸菌的Rf值并進行比較，結果見表1。Rf值為0.3−0.8，結果可信。
2.3.2形態特征鑒定結果
篩選的5株菌的菌落形態以及鏡檢結果如圖2和表2所示，5株菌的菌落均為圓形，但其直徑有較大差異，其中5-4的菌落為小菌落，1-2的菌落為大菌落，顏色均為乳白色，表面均光滑，邊緣整齊，鏡檢結果均為革蘭氏陽性，無芽孢的短桿菌，符合乳酸菌的特征。
2.3.3生化特性鑒定結果
由表3結果可以看出，篩選出的5株菌過氧化氫酶試驗、V-P試驗、尿素酶試驗和枸櫞酸鹽利用試驗均為陰性，無運動性，可以利用葡萄糖但不產氣，因此可判定為同型發酵乳桿菌。
由表4糖發酵試驗可見，篩選出的5株菌均可以利用D-核糖、阿拉伯糖、半乳糖、纖維二糖、果糖、水楊苷、蜜二糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖，均不能利用棉籽糖和木糖，對山梨醇、甘露醇和鼠李糖的發酵特性各不相同，其中菌株5-4可以利用山梨醇和鼠李糖，菌株1-1和7-5可以利用甘露醇。
分析上述試驗結果，根據《伯杰細菌鑒定手冊》[10]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[11]對菌株進行種內鑒定，菌株5-4與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)特性相似，但是不利用甘露醇，菌株7-5和1-1與小鼠乳桿菌(Lactobacillusmurinus)特性相似，但不利用棉籽糖，菌株6-6和1-2的特性與米酒乳桿菌(Lactobacillussake)特性相似，但不利用山梨醇。由于傳統的發酵特性不穩定因素較多，部分菌株親緣關系較近造成結果不容易區分[12]，所以需要進一步通過16SrRNA基因片段序列分析來鑒定。
2.3.416SrRNA基因片段序列分析結果
用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析16SrRNA基因的PCR產物，如圖3所示，試驗菌株和標準菌株均在1500bp處出現特異性目的條帶，與預期大小符合，而且產物條帶單一，滿足測序要求。
利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)將5株菌的16SrRNA基因片段序列與GenBank/EMBL/DDBJ數據庫中已知序列進行比對，5株菌均與植物乳桿菌(L.plantarum)的相似度最高，可達99%。利用MEGA5.0繪制系統發育樹進行同源性分析，結果如圖4所示，5株試驗菌株和標準菌株ZB均與植物乳桿菌(L.plantarum)的相似性最高，在系統發育樹上處于同一分支，與BLAST的分析結果相一致。可以判定5株菌均為植物乳桿菌(L.plantarum)。
2.4高產酸菌株的生理特性
2.4.1生長曲線
由菌株的生長曲線(圖5、6)和pH變化曲線(圖7)可以看出，菌株5-4和7-5的生長情況基本相似，延滯期較短，約2h開始進入對數期，8h進入穩定期，32h進入衰亡期，pH最低分別降至3.78和3.79。菌株1-1、1-2和6-6的生長情況相近，4h開始進入對數期，8h進入穩定期，對數期持續時間較短，但菌株生長較快，1-1和1-2在28h進入衰亡期，而菌株6-6在40h進入衰亡期，而且活菌數降低較為緩慢。3株菌的pH變化曲線較為平緩，最低pH分別為3.01、3.00和2.98，產酸能力較強。
2.4.2耐鹽試驗結果
由圖8可以得出，當培養基的NaCl濃度為2%時，所有試驗菌株的生長基本不受影響;當培養基的NaCl濃度為6%時，各菌株均受到輕微的抑制，而且受影響的程度相近;當培養基的NaCl濃度為10%時，5株菌的生長均受到明顯的抑制，受影響的程度同樣接近。
2.4.3pH試驗結果
由圖9可見，培養基的初始pH值對菌株生長有較大的影響，試驗的5株菌受初始pH的影響接近，在培養基pH<3.5時，所有試驗菌株的生長開始受到明顯的影響;其中菌株6-6在pH4.5時的OD600值顯著高于在其他pH，同樣也顯著高于其他試驗菌株在pH4.5時的OD600值。
2.4.4溫度和耐熱試驗結果
由圖10可以看出，試驗菌株在25°C正常生長，與標準37°C培養環境下的生長情況相比無明顯差異;所有試驗菌株在15°C生長良好，受低溫影響不明顯，其中菌株1-1和1-2在15°C時的OD600值略高于其余3株試驗菌株，45°C的高溫明顯影響菌株1-1和1-2生長，說明菌株1-1和1-2在低溫下生長良好，而試驗菌株5-4、6-6和7-5受高溫影響不明顯，在45°C下的OD600值略低于37°C條件下的OD600值，它們適于較高溫度環境中生長。
