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摘 要： 摘要：作者在前期試驗的基礎上篩選出5種(莖1、莖2、莖4、花2、姜4)對蘋果輪紋病菌菌絲有明顯抑制作用的內生細菌，并通過與蘋果輪紋病的對峙培養試驗，對其進一步的篩
摘要：作者在前期試驗的基礎上篩選出5種(莖1、莖2、莖4、花2、姜4)對蘋果輪紋病菌菌絲有明顯抑制作用的內生細菌，并通過與蘋果輪紋病的對峙培養試驗，對其進一步的篩選。結果表明，對蘋果輪紋病菌菌絲生長抑制效果最好的為從黃頂菊內分離出的花2，其次為從姜內分離的姜4和從黃頂菊內分離的莖2，抑制效果最差的則為從黃頂菊內分離的莖1。
關鍵詞：蘋果輪紋病;內生細菌;生物防治
蘋果是我國主栽的經濟作物之一。隨著蘋果種植面積的不斷擴大，蘋果輪紋病的危害日益嚴重，我國山東、遼寧、河北等地區均有發生，極大地影響果品產量和質量，造成重大的經濟損失。蘋果輪紋病一旦發生，輕則削弱樹勢，重則導致枯枝、死樹。據調查發現，我國蘋果果園總體發病率在70%以上，一般年份蘋果產量損失20%～30%，多雨年份則達到40%～60%[1]。
目前對蘋果輪紋病的防治主要是化學防治。化學農藥雖然有見效快、使用方便、可大規模應用等優點，但容易對環境造成污染和殘留在果品上，危害人類的健康。此外，化學藥劑的大量使用還會誘導病菌產生抗藥性。因此，采取一種高效、無毒、無污染的防治策略將成為研究防治蘋果輪紋病的重中之重[2]。生物防治是指利用拮抗性微生物而降低有害生物的作用，使其有益于有益生物[3]。
拮抗微生物的拮抗機制主要通過生防細菌產生抗生素、微生物之間的競爭作用及誘發植物自身的抗病性這3種方式發揮拮抗植物病害的作用。目前已有研究發現，利用熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluoreseus)防治小麥全蝕病[4]，利用枯草芽孢桿菌B903抑制蘋果輪紋病菌菌絲的擴散[5]。生物防治無殘留、無污染，對人和牲畜都沒有傷害，且能夠不傷害天敵和有益生物，保護自然生態平衡。植物內生菌作為一種天然生防菌，對于防治植物病害具有重要的意義[6]，有很大的開發應用前景，是值得人們努力研究探索的一個方向。
目前雖然國內外對植物內生菌的研究報道很多，但是利用微生物資源防治蘋果輪紋病的研究報道還很少。本文主要以蘋果的真菌病害為主要研究對象，利用對峙試驗的方法，從黃頂菊分離出來的花2、莖1、莖2、莖4及從姜內分離出的姜4，共5種內生細菌，從中篩選出對蘋果輪紋病具有廣譜拮抗能力的細菌，為開發綠色、高效、安全的新型微生物殺菌劑提供基礎。
1材料與方法
5種拮抗細菌如上述。蘋果輪紋病病菌由衡水學院生命科學系園林植物學實驗室提供。
1.15種內生細菌的活化
從冰箱中取出保存備用的5種內生菌(莖1、莖2、莖4、花2、姜4)，在無菌操作臺酒精燈周圍，將接種環放在酒精燈火焰上方灼燒至通紅，待其冷卻后將接種環深入細菌培養皿，輕輕挑取細菌劃線到新的NA固體平板上培養，每種細菌重復3次。接種后，將其放置到28℃恒溫生化培養箱中培養4~5d。
1.2蘋果輪紋病菌的復壯
首先需要對保存在低溫環境中的蘋果輪紋病菌進行活化。在超凈工作臺上，首先用火柴點燃酒精燈，在酒精燈外焰上灼燒打孔器，待打孔器冷卻，在酒精燈周圍用打孔器在培養皿邊緣打出直徑為1cm的菌餅，然后將菌餅置入PDA固體培養基，將培養皿置于28℃恒溫生化培養箱中培養4~5d，觀察病原菌的生長情況。
1.3蘋果輪紋病病菌菌絲生長的抑制試驗
細菌菌懸液的制備：在無菌操作臺上的酒精燈周圍，往培養好的細菌培養皿中注入適量無菌水，用玻璃棒輕輕刮取細菌，使其混在無菌水中，并用移液槍吸取，將其轉移至三角瓶中，密封。將三角瓶放置到振蕩器振蕩1min，使細菌與水混合均勻。
再用移液槍吸取振蕩好的菌懸液，滴入比色杯中，再將比色杯放入722分光光度計中，測定其OD值，并不斷調整濃度，使其最終的OD值為1.000。密封備用。對峙培養：用酒精燈外焰灼燒打孔器滅菌，待打孔器冷卻后，在超凈工作臺上的酒精燈周圍，用直徑為1cm的打孔器在活化后的蘋果輪紋病培養基上打孔，挑取菌餅倒扣在新的PDA平板上。在平板的外圍分別均勻放置3個濾紙片，打開裝有菌懸液的三角瓶，用移液槍吸取制備好的細菌菌懸液50μL，分3次將其滴在濾紙片上，每種細菌重復3次。同時用無菌水作對照。將所有的PDA平板置于28℃的恒溫生化培養箱中培養4~5d。
1.4抑菌圈直徑的測定
5種內生細菌與蘋果輪紋病病菌進行對峙培養試驗，對蘋果輪紋病病菌進行拮抗測定。測定蘋果輪紋病病菌菌落直徑，計算抑菌效果。用Excel軟件對數據進行處理和作圖，用Spss17.0進行方差分析，差異顯著性水平位5%(p≤0.05)。
2結果與分析，5種內生細菌對蘋果輪紋病菌均有抑制作用，其中從黃頂菊花內分離的花2對病原菌的拮抗性最大，抑制效果最好;從姜內分離的姜4和從黃頂菊內分離的莖2次之;抑制效果最差的則是從黃頂菊內分離的莖1。
平均抑菌率依次為55.026%、46.032%、44.444%、34.391%、26.455%前三者間差異不顯著，但顯著高于后二者;后二者間差異不顯著。
3小結與設想
植物病害的生物防治相較化學防治具有無與倫比的優勢，已成為當今研究的熱點。但植物內生菌作為生防因子應用的潛力還未完全開發出來，多數生防制劑的效果還不能令人滿意。本試驗研究表明，花2、莖2和姜4對蘋果輪紋病菌菌絲具有良好的拮抗作用，這為進一步研究防治蘋果輪紋病的有效生物制劑奠定了基礎。今后要對蘋果輪紋病菌菌絲拮抗效果好的內生細菌進行形態學和生物學上的鑒定，同時分析黃頂菊和姜內分離的內生細菌起拮抗作用的成分，并研究其拮抗機理。
參考文獻：
[1]范昆，付麗，張勇，等.10種殺菌劑對蘋果輪紋病菌的室內毒力及田間防治效果研究[J].江西農業學報，2016，28(10)：32-35.
[2]王海明，鄧德法，王惠玉.淺談生物防治技術在蘋果病害防治中的應用[J].落葉果樹，2014，46(2)：22-23.
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