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摘要: 目的: 觀察消炎退熱合劑對脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 誘導的肺損傷模型小鼠肺組織中炎性因子表達的影響。方法: 取 ICR 小鼠，采用多次腹腔注射 LPS 建立小鼠肺損傷模型，隨機分為模型組，地塞米松組( 2 mg·kg - 1 ) ，消炎退熱合劑小劑量組( 3 g·kg - 1 ) 、中劑量組( 6 g·kg - 1 ) 、大劑量組( 12 g·kg - 1 ) 。各組灌胃給藥，連續 4 周。末次給藥后 2 h 采血，測定血清白細胞介素( interleukin，IL) - 4、IL - 12、IL - 10、干擾素 - γ( interferon - γ，IFN - γ) 、IL - 6、腫瘤壞死因子 - α( tumor necrosis factor，TNF - α) 水平; PBS 磷酸緩沖液進行肺灌洗，檢測灌洗液中的 IL - 6 和 TNF - α 水平。取左肺組織，常規石蠟切片，HE 染色，光鏡下觀察肺組織病理學特征。結果: 消炎退熱合劑中劑量組、大劑量組右上葉組織濕質量/干質量顯著低于模型組( P < 0. 01) 。與模型組比較，消炎退熱合劑小劑量組、中劑量組、大劑量組的 IL - 12、IFN - γ、 IL - 10 和 IL - 4 水平均顯著降低( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ; 肺泡灌洗液中，消炎退熱合劑小劑量組、中劑量組、大劑量組的 IL - 6 水平明顯降低( P < 0. 01) ，消炎退熱合劑大劑量組中 TNF - α 水平明顯降低( P < 0. 05) 。HE 染色結果顯示，與模型組比較，消炎退熱合劑大劑量組小鼠肺泡間隔僅局部有輕度增厚，輕度炎細胞浸潤，無出血。結論: 消炎退熱合劑能有效降低 LPS 誘導的肺損傷模型小鼠的炎癥水平。文獻引用: 曹瑞，張軍武，董冰，等. 消炎退熱合劑對脂多糖致急性肺損傷模型小鼠炎癥因子表達的影響[J]. 中醫學報， 2020，35( 5) : 1055 - 1058.
關鍵詞: 消炎退熱合劑; 急性肺損傷; 白細胞介素; 干擾素 - γ; 腫瘤壞死因子 - α; 脂多糖; 小鼠
細菌感染引起的急性肺損傷( acute lung injury， ALI) 是臨床上常見的危急重癥之一，病 死 率 為 35% ～ 40%[1]。脂多糖( lipopolysaccharide，LPS) 可活化炎性細胞，釋放大量炎性細胞因子[2]，導致肺泡內毛細血管膜損傷、肺泡表面活性物質功能失調及肺水腫[3]。在 ALI 發展過程中，有白細胞介素 - 1 ( interleukins - 1，IL - 1) 、IL - 6、IL - 10、IL - 12、腫瘤細胞因子( tumor necrosis factor，TNF - α) 、干擾素 - γ( interferon - γ，IFN - γ) 等多種細胞因子參與[4]。這些細胞因子作為信號分子在局部和全身水平進行引發、擴增和延續，在 ALI 的炎性級聯反應中占據主導地位，因此，控制炎癥反應是治療 ALI 的關鍵[5]。根據臨床表現，肺部感染屬中醫學暴喘、喘脫、溫病等范疇，有痰熱壅肺證、痰濁阻肺證、邪熱閉竅證、肺熱腑實證、氣滯血瘀證等多種證候，表現為 “喘”“昏”“滿”“熱”并見，尤以上喘下滿為多。消炎退熱合劑由大青葉、蒲公英、紫花地丁和甘草 4 味中藥組成，具有清熱消毒，涼血消腫功效[6]，主要用于感冒發熱，上呼吸道感染，咽喉腫痛及各種瘡癰腫痛[7]。本研究采用多次腹腔注射 LPS 建立 ALI 小鼠模型，探討消炎退熱合劑抗 ALI 的藥理作用及機制。
1 材料與方法
1. 1 藥品與試劑 消炎退熱合劑( 陜西中醫藥大學制藥廠，批號: 18K06106) ; 醋酸地塞米松片( 新鄉市常樂制藥有限責任公司，批號: 1804176) ; 小鼠 IL - 4 試劑盒( 批號: EIA - 2018) 、IL - 12 試劑盒 ( 批號: EIA - 2544) 、IL - 10 試劑盒( 批號: EIA - 2012) 、IFN - γ 試劑盒( 批號: EIA - 2004) 、IL - 6 試劑盒( 批號: EIA - 2019) 、TNF - α 試劑盒( 批號: EIA - 2226) ，由艾萊薩生物科技有限公司提供。
1. 2 實驗動物 ICR 小鼠，SPF 級，雌雄各半，質量為 18 ～ 22 g，由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供，合格證號: SCYK( 陜) 2017 - 003。飼養條件: 陜西中醫藥大學中藥藥理實驗室( 國家中醫藥管理局中醫藥科研三級實驗室) 飼養，室溫 20 ～ 25 ℃，相對濕度 45% ～ 70% 。
1. 3 實驗儀器 全波長酶標儀( UR1T - 660) 、微量移液器( 17120658) 、電子天平等。
1. 4 實驗方法 取 ICR 小鼠 60 只，隨機取 10 只作為正常組，其余分別參考文獻方法[8-9]每 3 天腹腔注射 LPS 2 mg·kg - 1 1 次，連續 8 次后改為每天 1 次，持續 4 d，建立小鼠肺損傷模型。正常組小鼠腹腔注射等容積的生理鹽水。在造模過程中，檢測小鼠體溫及一般體征，以體溫上升為成模標準。將成模小鼠隨機分為模型組、地塞米松組( 2 mg·kg - 1 ) 和消炎退熱 合 劑 小 劑 量 組 ( 3 g · kg - 1 ) 、中 劑 量 組 ( 6 g·kg - 1 ) 、大劑量組( 12 g·kg - 1 ) 。各組每天灌胃給藥 1 次，正常組、模型組小鼠給予等容積的生理鹽水，連續 4 周。末次給藥后 2 h，于小鼠眼球取血，分離血清，按照試劑盒說明書操作，采用酶聯吸附法測定血清中 IL - 12、IFN - γ、IL - 4、IL - 10 的水平。處死動物，取小鼠肺右上葉稱濕質量，置于 80 ℃ 恒溫箱干燥至恒定，稱質量，計算肺右上葉組織濕質量/干質量。用 PBS 進行肺泡灌洗，測定灌洗液中的 IL - 6、TNF - α 水平。摘取部分左肺組織，以 40 g·L - 1 多聚甲醛固定，常規切片，HE 染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變。
1. 5 統計學方法 采用 SPSS 19. 0 統計軟件進行數據分析。數據采用均數 ± 標準差( x珋± s) 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 t 檢驗。P < 0. 05 為差異有統計學意義。
2 結果
2. 1 各組小鼠肺右上葉濕質量/干質量比較 模型組小鼠肺右上葉濕質量/干質量明顯高于正常組 ( P < 0. 01) ，消炎退熱合劑中劑量組、大劑量組與模型組比較，濕質量/干質量顯著降低( P < 0. 01) 。見表 1。
2. 2 各組小鼠血清 IL - 12、IFN - γ、IL - 4、IL - 10 水平比較 模型組小鼠血清 IL - 12、IFN - γ 明顯高于正常組( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ，而 IL - 10 和 IL - 4 明顯降低( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ; 與模型組比較，消炎退熱合劑小劑量組、中劑量組、大劑量組的 IL - 12、IFN - γ 的水平均有不同程度地降低 ( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ，而 IL - 10、IL - 4 水平明顯升高( P < 0. 05 或 P < 0. 01) 。見表 2。
2. 3 各組小鼠肺泡灌洗液中 IL - 6、TNF - α 水平比較 模型組小鼠肺泡灌洗液中 IL - 6、TNF - α 明顯高于正常組( P < 0. 05 或 P < 0. 01) ; 與模型組比較，消炎退熱合劑小劑量組、中劑量組、大劑量組的 IL - 6 明顯降低( P < 0. 01) ，消炎退熱合劑大劑量組小鼠肺泡灌洗液中 TNF - α 明顯降低( P < 0. 05) 。見表 3。
2. 4 各組小鼠肺組織病理學比較 肺組織鏡下觀察顯示: 正常組小鼠肺泡結構完整，無出血、炎細胞浸潤以及間隔增厚。模型組肺泡間隔增厚，間質有大量炎細胞浸潤，伴隨出血; 消炎退熱合劑小劑量組肺泡間隔增厚，間質有輕度炎細胞浸潤，伴隨出血; 消炎退熱合劑中劑量組肺泡間隔僅局部有輕度增厚，輕度炎細胞浸潤，伴隨出血; 消炎退熱合劑大劑量組肺泡間隔僅局部有輕度增厚，輕度炎細胞浸潤，無出血; 地塞米松組切片在鏡下可見肺泡間隔僅局部有輕度增厚，輕度炎細胞浸潤，輕度出血。見圖 1。
3 討論
AIL 發病機制比較復雜，病情發展迅速，且病死率高[10]。LPS 是革蘭陰性細菌的主要致病成分，也是引起 AIL 并最終導致患者死亡的常見原因[11]。 AIL 以肺微血管通透性增高、肺泡腔滲出富含蛋白質的液體、肺水腫及透明膜的形成，并且伴有肺間質纖維化為主要的病理特征[12]，臨床上表現為進行性加重的呼吸困難和頑固性低氧血癥，影像學上表現為雙肺滲出性病變[13]。LPS 可導致肺泡毛細血管內皮細胞、肺泡上皮細胞和肺間質水腫，其本質是肺部各種炎性細胞聚集激活浸潤和大量炎性介質的釋 放，形成肺損傷[14]。研究發現，肺泡巨噬細胞是多種炎癥細胞因子的主要來源，在肺泡腔中，肺泡巨噬細胞分泌細胞因子，這些炎性細胞因子主要有 IL - 1、6、8、12、IFN - γ 和 TNF - α [15]，其主要作用是局部刺激嗜中性粒細胞趨化并激活。其中 TNF - α 是人體內主要的促炎和免疫調節因子，同時參與介導 ALI 過程。TNF - α 能促進血管內皮細胞黏附分子的表達，刺激肺內皮細胞、巨噬細胞的活化和遷移，并通過誘導細胞因子的分泌引發炎癥反應。IFN - γ 可以介導許多與肺臟生理有關的前炎性反應; 誘導巨噬細胞產生 IL - 1、TNF - α、IL - 6 和 IL - 8 等; 具有促炎癥反應的作用[16]。ALI 是多種炎癥介質反應及相互作用的結果，促炎因子與抗炎因子之間的動態平衡是影響 ALI 的重要因素。然而，細胞因子之間的相互作用極其復雜，并且細胞因子之間并非各自孤立，它們之間相互聯系，相互影響形成細胞因子網絡，相互制約，一旦這個動態平衡被打破，則可發生細胞因子或炎性介質失控性釋放，導致肺組織及全身靶器官組織損傷，導致 ALI 發生與發展[17]。
消炎退熱合劑由大青葉、蒲公英、紫花地丁、甘草組成。其中，大青葉清熱解毒、涼血消斑，是涼血解毒之要藥[18]; 紫花地丁味苦性寒，有清熱解毒、消腫散結之功，歷來為治療紅腫、熱痛之常用藥，主治黃疸內熱、癰疽惡瘡、癰疽發背、疔瘡腫毒、喉痹腫痛等[19]; 蒲公英清熱解毒、利尿散結，主治感冒發熱、扁桃體炎、急性咽喉炎、急性支氣管炎等; 蒲公英和紫花地丁二者配伍，可達清熱、散火、解毒、消腫之目的[20]; 甘草性平味甘，具有補中益氣、潤肺止咳、清熱解毒、緩急止痛、調和諸藥之功[21]。諸藥配伍，共奏清熱解毒、涼血消腫、抗炎之功，主要用于感冒發熱、上呼吸道感染、咽喉腫痛及各種瘡癰腫痛。本研究發現，消炎退熱合劑小劑量組、中劑量組、大劑量組能不同程度降低 LPS 誘導的小鼠血清中 IL - 12、 IFN - γ 水平，并升高抗炎因子 IL - 10 和 IL - 4 水平; 使小鼠肺泡灌洗液中的致炎細胞因子 IL - 6 明顯降低，消炎退熱合劑大劑量組 TNF - α 水平明顯降低。HE 染色結果顯示，消炎退熱合劑組大劑量組可保護小鼠肺組織，減輕肺泡間隔增厚，炎細胞浸潤等現象。
綜上，消炎退熱合劑對小鼠的肺炎有一定的治療效果，為其治療呼吸道感染性疾病的進一步研究提供實驗依據。——論文作者：曹瑞1 ，張軍武2 ，董冰1 ，王興海2 ，樊修和2 ，劉繼平1 ，賀磊2
本文來源于：《中醫學報》是中華中醫藥學會系列期刊之一，從不同側面報道臨床最新研究成果，注重學術熱點和理論創新，介紹中醫藥治療新成果、新經驗、新技術，全方位反映中醫理法方藥的現代研究成果，眾多欄目各有側重，勾勒各專業學術風景。現有常設欄目為：“論著”“述評”“名醫心法”“實驗研究”“中藥研究”“臨床研究”“針灸與推拿”;非常設欄目為：“本刊特稿”“學術爭鳴”“思路與方法”“標準與規范”“中醫文獻”“流派研究”。
