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摘 要： 摘要目的：建立以決明子中萘并吡喃酮類對照提取物和對照品為對照物質的脂康顆粒含量測定方法并對結果進行對比分析，探討中藥對照提取物替代單體對照品在中藥復方質量控制中應用的適用性和可行性。方法：分別以紅鐮霉素-6-O--D-龍膽二糖苷、決明子苷B2、決明
摘要目的：建立以決明子中萘并吡喃酮類對照提取物和對照品為對照物質的脂康顆粒含量測定方法并對結果進行對比分析，探討中藥對照提取物替代單體對照品在中藥復方質量控制中應用的適用性和可行性。方法：分別以紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷、決明子苷B2、決明子苷C、決明子苷C2這4個對照品和已知含量的決明子對照提取物為對照，采用高效液相色譜法，測定4種成分在脂康顆粒復方中的含量，并對兩種方法所得的結果進行t檢驗。結果：實驗結果表明，4種成分的含量在對照提取物法與對照品法比較下，差異有統計學意義(均P>0.05)，說明對照提取物可以作為脂康顆粒質量控制中的對照物質。結論：該研究結果為萘并吡喃酮類對照提取物用于含決明子的中藥復方的質量評價提供了科學依據和研究基礎，對中藥對照提取物代替化學對照品進行中藥復方質量控制的可行性和適用性進行了驗證。
關鍵詞決明子;對照提取物;紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷;決明子苷B2;決明子苷C;決明子苷C2;脂康顆粒;質量控制
中藥對照提取物是中藥的“標準”提取物，是一類非單體成分對照品，一般通過特殊的提取分離工藝制備而成[1]。它具有化學成分組成相對明確、指標成分含量確切、適合多成分分析等特點，可用于薄層色譜或其他色譜鑒別，以及高效液相色譜法的含量測定[2]。對照提取物首次在2005年版《中國藥典》中作為中藥標準物質出現[3]，并且隨著藥典修訂工作的不斷推進，有更多數量的對照提取物被收載和應用。2020年版《中國藥典》(四部)中就收載了人參莖葉總皂苷、三七總皂苷、廣陳皮對照提取物、銀杏葉提取物等23種對照提取物[4]。美國藥典(USPharmacopoeia，USP)和歐洲藥典(EuropeanPharmacopoeia，EP)對于對照提取物也有相應的收載和應用[5-7]。雖然中藥對照提取物僅在對照物質總數量中的比例并不大，但是中藥對照提取物具備一些特點和優勢，能夠彌補中藥化學對照品和對照藥材在生產、供應、使用等環節中存在的不足，對中藥質量標準的完善和檢測效率的提高具有促進作用[8]。
中藥復方是中醫用藥的重要形式，在中醫藥醫療活動中發揮著不可替代的作用。中藥復方的功效發揮是其所含有效成分綜合作用的結果，是多成分、多靶點、多途徑作用的體現[9]。因此，中藥復方的質量控制和評價研究應依據其特點開展。近年來，中藥復方質量控制方法研究成為中藥現代化的重要的研究領域之一[10]。為了保障中藥復方制劑的安全性與有效性，中醫藥學者開展了大量的系統研究，旨在建立符合中藥復方質量特點的系統、科學、全面的質量控制方法。
現階段，中藥質量控制基本都是借鑒化學藥品的控制模式，采用單一對照品評價中藥質量，這種方法由于中藥成分的多樣性及復雜性，往往具有一定的局限性。而對照提取物可以同時對多個組分進行含量測定，體現了中藥整體質量控制的思想。將中藥對照提取物應用于中藥及中藥復方質量控制具有獨特的優勢：相對固定的化學組成，安全、穩定的理化特性;專屬性較強;可以減少化學對照品的使用，降低檢驗成本;配制操作簡單，溶解于有機溶劑后可直接使用，使藥品檢測更加簡便、快捷[11]。因此，開展中藥對照提取物研究并探索將其用于中藥及中藥復方的質量控制具有較強的實際應用意義，能夠解決目前中藥質量控制研究中的諸多問題。
決明子為豆科植物鈍葉決明CassiaobtusifoliaL.或決明(小決明)CassiatoraL.的干燥成熟種子。具有清熱明目，潤腸通便的功效。臨床常用于目赤澀痛，羞明多淚，頭痛眩暈，目暗不明，大便秘結[12]。決明子作為脂康顆粒中的重要藥味，由決明子、枸杞子、桑椹、紅花、山楂四味中藥組成，具有滋陰清肝，活血通絡的作用，臨床上可用于肝腎陰虛挾瘀所引起的高脂血癥等疾病的治療[13]。課題組前期系統開展了決明子萘并吡喃酮類對照提取物制備及定值研究，并將其應用于決明子藥材的質量控制與評價[14-18]。文獻及前期研究結果顯示，將中藥對照提取物用于中藥及中藥復方的質量控制，穩定性、重復性良好，結果準確度高、可行性強[19-22]。在此基礎上，以脂康顆粒為例，分別采用化學對照品法和對照提取物法，建立含有決明子的中藥制劑脂康顆粒的含量測定方法，并對測定結果進行對比分析。進一步探討決明子萘并吡喃酮類對照提取物用于中藥復方質量控制中的可行性和適用性，為全面評價決明子藥材及復方質量提供研究基礎，為中藥對照提取物在中藥復方質量控制與評價工作中的適用性和可行性提供科學依據。
1儀器與試藥
1.1儀器循環水式多用真空泵(上海振捷實驗設備有限公司，型號：SHB-Ⅲ);數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500DE);高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司，美國，型號：1525型);AgilentZORBAXSB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)(安捷倫科技(中國)有限公司，美國，型號：ZORBAXSB-C18);十萬分之一電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司，型號：SartoriousBT25S)。
1.2試劑決明子苷B2對照品、決明子苷C2對照品、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷對照品、決明子苷C對照品由北京中醫藥大學中藥學院自制，經過結構鑒定及色譜檢測計算，純度均大于98%;乙腈、甲醇為色譜純(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，美國，批號：155805);哇哈哈純凈水;甲醇為分析純(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2020121025);乙醇為分析純(天津市大茂化學試劑廠，批號：20190806);乙酸為分析純(汕頭市西隴化工廠有限公司，批號：080312)。
1.3分析樣品枸杞、桑葚、山楂、紅花4種藥材和各批次脂康顆粒樣品均由同仁堂(望京店)提供。
2方法與結果
2.1對照品用于脂康顆粒含量測定
2.1.1色譜條件色譜柱：AgilentZORBAXSB-C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm);流動相：甲醇乙腈(5:4)混合溶液(A)-1%乙酸水(B)等度洗脫(0~30min，19%A);流速：1mL/min;檢測波長：278nm;柱溫：35℃。混合對照品、供試品和陰性樣品色譜圖見圖1。
2.1.2對照品溶液的制備精密稱取決明子苷B2對照品2.75mg、決明子苷C2對照品2.35mg、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷對照品4.73mg、決明子苷C對照品7.96mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液A。精密吸取3mL混合對照品溶液A，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液B;精密吸取3mL混合對照品溶液B，置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液C;重復以上步驟直至制得混合對照品溶液E。
2.1.3供試品溶液的制備精密稱定脂康顆粒1g，加入50mL水溶解，上樣于內徑為2cm，高度為25cm的大孔吸附樹脂柱，柱體積為80mL，先用320mL20%乙醇洗脫除雜后，再用480mL50%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加30%甲醇溶解，轉移至25mL量瓶中，加30%甲醇并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
2.1.4陰性樣品溶液的制備取枸杞、桑葚、山楂、紅花4味藥材適量，按照處方3:3:3:1的比例，加水煎煮二次，第一次1.5h，第二次1h，濾過，濾液合并，減壓濃縮成相對密度為1.05~1.10(60℃)的浸膏，加入麥芽糊精適量，混勻，噴霧干燥;浸膏粉中加入麥芽糊精適量和硬脂酸鎂5g，混勻，干法制粒，即得陰性樣品。按供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。
2.1.5線性關系考察精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液A~F各10μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。以對照品進樣量(x)為橫坐標，色譜峰峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸。決明子苷B2線性范圍為0.004455~0.55μg;決明子苷C2線性范圍為0.003807~0.47μg;紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷線性范圍為0.0076626~0.946μg決明子苷C線性范圍為0.012895~1.592μg。
2.1.6儀器精密度試驗分別精密稱取同一供試品溶液6份，每次進樣10μL，以色譜峰峰面積，計算RSD分別為0.58%、0.87%、0.90%、0.79%，RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。
2.1.7中間精密度試驗分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.1.3”項下方法由不同的分析人員在不同的時間制備脂康顆粒樣品溶液，分別采用Waters1525-2998-2707和Waters1525-2489高效液相色譜儀測定峰面積。決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷及決明子苷C的含量分別為0.080%(RSD=0.77%)，0.010%(RSD=1.20%)，0.152%(RSD=0.93%)，0.042%(RSD=1.05%)，表明該方法中間精密度良好。
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2.1.8供試品溶液穩定性試驗取“2.1.3”項下供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24h進樣，測定色譜峰峰面積。計算RSD分別為1.01%，0.72%，1.23%和0.57%。表明該溶液在制備后24h內穩定性良好。
2.1.9重復性試驗分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積。RSD值均小于3%，表明重復性良好。
2.1.10回收率試驗分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份0.5g，加入對照品溶液適量，按“2.1.3”項下方法制備加樣回收供試品溶液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。計算回收率及RSD，結果見表1，RSD均小于3%，表明回收率良好。
2.2對照提取物用于脂康顆粒含量測定
2.2.1色譜條件采用“2.1.1”項條件，對照提取物、供試品及陰性樣品溶液色譜圖見圖2。
2.2.2對照提取物溶液的制備精密稱取已標定含量的決明子萘并吡喃酮類對照提取物12.88mg，置于25mL容量瓶中，加30%甲醇超聲溶解，靜置，定容，搖勻，即得對照提取物溶液A。精密吸取3mL對照提取物溶液A于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對照提取物溶液B;精密吸取3mL對照提取物溶液B于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得對照提取物溶液C;重復以上步驟直至制得對照提取物溶液E。
2.2.3供試品溶液的制備精密稱定脂康顆粒1g，加入50mL水溶解，上樣于內徑為2cm，高度為25cm的大孔吸附樹脂，柱體積為80mL，320mL20%乙醇洗脫除雜后，用480mL50%乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加30%甲醇溶解，轉移至25mL量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。
2.2.4陰性樣品溶液的制備取枸杞、桑葚、山楂、紅花4味藥材適量，按照處方3:3:3:1的比例，加水煎煮二次，第一次1.5h，第二次1h，濾過，濾液合并，減壓濃縮成相對密度為1.05~1.10(60℃)的浸膏，加入麥芽糊精適量，混勻，噴霧干燥;浸膏粉中加入麥芽糊精適量和硬脂酸鎂5g，混勻，干法制粒，即得陰性樣品。按“2.1.3”項下方法制得陰性樣品溶液。
2.2.5線性關系考察精密吸取“2.2.2”項下混合對照提取物溶液A~F各10μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。以對照品進樣量(x)為橫坐標，色譜峰峰面積(y)為縱坐標，進行線性回歸。決明子苷B2線性范圍為0.004455~0.55μg;決明子苷C2線性范圍為0.003807~0.47μg;紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷線性范圍為0.0076626~0.946μg決明子苷C線性范圍為0.012895~1.592μg。
2.2.6儀器精密度試驗分別精密稱取同一供試品溶液6份，每次進樣10μL，以色譜峰峰面積，計算RSD分別為0.74%、0.91%、0.85%、1.20%，RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。
2.2.7中間精密度試驗分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.2.3”項下方法由不同的分析人員在不同的時間制備脂康顆粒樣品溶液，分別采用Waters1525-2998-2707和Waters1525-2489高效液相色譜儀測定峰面積。決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷及決明子苷C的含量分別為0.081%(RSD=0.91%)，0.010%(RSD=1.23%)，0.151%(RSD=0.95%)，0.040%(RSD=1.02%)，表明該方法中間精密度良好。
2.2.8供試品溶液穩定性試驗取“2.2.3”項下供試品溶液，分別于制備后0，2，4，8，16，24h進樣，測定4種指標性成分的色譜峰峰面積，計算RSD分別為1.10%，1.43%，0.97%和1.24%。表明該溶液在制備后24h內穩定性良好。
2.2.9重復性試驗分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份1g，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，測定峰面積。RSD值均小于3%，表明該方法重復性良好。
2.2.10回收率試驗分別精密稱取同一批脂康顆粒6份，每份0.5g，加入對照提取物溶液適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積。計算回收率及RSD，結果見表2，RSD均小于3%，表明回收率良好。
2.3復方脂康顆粒含量測定
精密稱取12批脂康顆粒粉末，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別以4個對照品和已知含量的決明子對照提取物為對照，采用高效液相色譜法，測定4種成分的含量，并對不同方法所得的結果進行t檢驗，實驗結果如表3所示。決明子苷B2、決明子苷C2、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷和決明子苷C的P值分別為0.233、0.082、0.192、0.198，P值均大于0.05，說明對照提取物可以作為脂康顆粒質量控制中的對照物質，代替相應的化學對照品進行質量評價。——論文作者：張顏周德勇王路高艷艷林天鳳劉斌姜艷艷
