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摘 要： 摘要CXXC鋅指蛋白1(CXXCfingerprotein-1,CFP1)是一種表觀遺傳調(diào)控因子，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)參與DNA甲基化和組蛋白修飾。研究表明CFP1的失調(diào)影響細(xì)胞的基因表達(dá)、DNA損傷修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分裂、分化等，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療及不良預(yù)后密切相關(guān)。本
摘要CXXC鋅指蛋白1(CXXCfingerprotein-1,CFP1)是一種表觀遺傳調(diào)控因子，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)參與DNA甲基化和組蛋白修飾。研究表明CFP1的失調(diào)影響細(xì)胞的基因表達(dá)、DNA損傷修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、分裂、分化等，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療及不良預(yù)后密切相關(guān)。本文簡(jiǎn)要綜述CFP1的基本功能及在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展，以期為后續(xù)研究新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
關(guān)鍵詞CXXC1;H3K4me3;DNMT1;惡性腫瘤;表觀遺傳學(xué)
近年來(lái)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)惡性腫瘤的表觀基因組進(jìn)行了大規(guī)模的系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)有不同程度的轉(zhuǎn)錄控制失調(diào)，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的異常表達(dá)等，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。隨著表觀遺傳學(xué)的迅猛發(fā)展，一些未知的表觀調(diào)節(jié)子相繼被發(fā)現(xiàn)。1999年,研究者通過(guò)雙鏈寡核苷酸探針成功分離出一種新型編碼人類CpG結(jié)合蛋白-CXXC鋅指蛋白1(CXXCfingerprotein-1,CFP1)的cDNA，CFP1基因位于人染色體18q21.1區(qū)域，全長(zhǎng)2487bp，轉(zhuǎn)錄生成的蛋白由656個(gè)氨基酸序列組成，定位于細(xì)胞核中[2]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)CFP1蛋白只能與未甲基化的核苷酸序列結(jié)合，通過(guò)調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)參與胞嘧啶甲基化[3]。CFP1也是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set1的亞基，于H3組蛋白4號(hào)賴氨酸上進(jìn)行三甲基化(H3K4me3)，使染色質(zhì)處于開(kāi)放狀態(tài)促進(jìn)基因表達(dá)[4]。CFP1在DNA甲基化和組蛋白修飾中發(fā)揮重要作用，可能和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CFP1發(fā)生基因突變、異常表達(dá)和與DNMT1結(jié)合障礙等對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)或抑制作用。本文簡(jiǎn)要綜述CFP1的基本功能及在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展，以期為后續(xù)研究新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
1.CXXC1的基本功能
1.1CFP1與DNA甲基化
DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)催化作用下在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號(hào)碳原子上共價(jià)結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，能引起DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而調(diào)控基因表達(dá)[5]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，DNMT3a和DNMT3b完成DNA初始甲基化，DNMT1維持DNA的甲基化狀態(tài)[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)DNMT1在DNA初始甲基化中同樣發(fā)揮重要作用[7]。在許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組中存在大量散在的甲基化的CpG二核苷酸，而在某些區(qū)域，如基因的啟動(dòng)子處存在高度聚集的CpG二核苷酸，它們被稱為CpG島(CpGislands,CGIs)，大約72%的人類基因啟動(dòng)子位于CGIs，它們的甲基化水平很低[8]。基因啟動(dòng)子區(qū)域CGIs的甲基化與基因沉默密切相關(guān)，甲基化的DNA可以招募甲基結(jié)合蛋白(methyl-bindingdomainproteins,MBDs)抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。而在腫瘤細(xì)胞中CGIs往往呈高甲基化狀態(tài)，這種高甲基化狀態(tài)是導(dǎo)致抑癌基因失活的一個(gè)重要機(jī)制[9]。
CFP1通過(guò)調(diào)控DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)參與胞嘧啶甲基化，Butler等[10]研究發(fā)現(xiàn)缺乏CFP1的小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)整體基因組70%的胞嘧啶甲基化下降，并伴隨著多聚核糖體水平降低,導(dǎo)致翻譯起始降低。盡管DNMT1轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，但DNMT1蛋白合成減少。通過(guò)脈沖/chase分析結(jié)果顯示在CFP1缺失的小鼠胚胎干細(xì)胞(ES)中DNMT1蛋白半衰期也有一定程度的降低。基于以上結(jié)果，Tate等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)缺乏CFP1的胚胎干細(xì)胞參與DNA堿基切除修復(fù)的核酸內(nèi)切酶(Apyrimidinicendonuclease/Redoxfactor-1,Ape1/Ref-1)蛋白表達(dá)下降，DNA損傷增加。這些結(jié)果揭示了Cfp1在翻譯起始及DNA損傷修復(fù)中的作用，表明CFP1缺失會(huì)導(dǎo)致基因組胞嘧啶甲基化水平下降、DNMT1蛋白合成和半衰期降低及DNA損傷增加。
1.2CFP1與組蛋白修飾
組蛋白與DNA共同組成核小體,是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，組蛋白氨基末端(N端)結(jié)構(gòu)域伸出核小體可同其他調(diào)節(jié)蛋白和DNA發(fā)生相互作用。其N端尾區(qū)可進(jìn)行乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、蘇素化、ADP核糖基化等修飾，可改變?nèi)旧|(zhì)的狀態(tài)以及調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。
組蛋白甲基化修飾相關(guān)蛋白主要包含組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMTs)和組蛋白去甲基轉(zhuǎn)移酶(HDMTs)。組蛋白甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響較為復(fù)雜，主要取決于被修飾的氨基酸位點(diǎn)，而甲基化程度又分為三個(gè)水平，分別為一甲基化、二甲基化、和三甲基化(me1/me2/me3)即分別在同一個(gè)氨基酸位點(diǎn)添加一個(gè)甲基、兩個(gè)甲基和三個(gè)甲基[13]。某些被沉默的抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域均可發(fā)現(xiàn)H3K4me2/3修飾的缺失以及H3K9me2/3、H3K27me3修飾的獲得[14]。大多數(shù)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶都通過(guò)Set結(jié)構(gòu)域來(lái)發(fā)揮主要功能，CFP1作為組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶Set1的組成單位與未甲基化的CpG島結(jié)合定位H3K4me3到染色質(zhì)上，從而調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)基因表達(dá)[3]。
Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)在卵母細(xì)胞中CFP1修飾的H3K4me3與基因啟動(dòng)子相關(guān)，并在發(fā)育過(guò)程中使啟動(dòng)子激活并轉(zhuǎn)錄。Sha等[16]研究發(fā)現(xiàn)在成熟卵母細(xì)胞中CFP1是H3K4me3積累和沉積在染色質(zhì)上所必要的蛋白，缺乏CFP1將導(dǎo)致H3K4me3降低，進(jìn)一步導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性下降、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂障礙、受精后無(wú)法完全成熟。基于以上結(jié)果，Sha等[17]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞缺失CFP1，直接破壞了基因表達(dá)模式，間接破壞了促黃體激素的作用和損害了促卵泡激素對(duì)顆粒細(xì)胞的基本信號(hào)通路，導(dǎo)致卵泡生長(zhǎng)和排卵均受到影響。以上研究表明CFP1對(duì)H3K4me3的修飾對(duì)卵母細(xì)胞增值、減數(shù)分裂、基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要。
2CXXC1在惡性腫瘤中的研究
2.1CFP1與胃癌
胃癌是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，是癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因，越來(lái)越多的研究表明胃癌的表觀遺傳異常可以促進(jìn)癌變發(fā)生[18]。Sun等[19]對(duì)84例胃癌患者進(jìn)行了研究，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)胃癌組織中CFP1與14-3-3蛋白表達(dá)水平，并進(jìn)行相關(guān)性分析。14-3-3蛋白在哺乳動(dòng)物中存在7個(gè)亞型(α/β,γ,ε,ζ,η,σ和θ/τ),由不同的基因編碼，可參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞遷移、分化、凋亡等過(guò)程[20]。14-3-3σ編碼基因的甲基化會(huì)導(dǎo)致14-3-3σ蛋白在腫瘤細(xì)胞中持續(xù)低表達(dá)，會(huì)對(duì)P53產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在同一視野中CFP1的表達(dá)量與14-3-3蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，CFP1呈高表達(dá)的患者總體生存時(shí)間小于呈低表達(dá)的患者，而14-3-3蛋白對(duì)患者生存時(shí)間的影響則與CFP1相反。Mai等[22]研究發(fā)現(xiàn)CFP1與14-3-3蛋白之間的相互作用與核因子κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)蛋白有關(guān)，在B細(xì)胞中14-3-3蛋白的表達(dá)依賴于NF-κB蛋白在14-3-3基因啟動(dòng)子區(qū)募集CFP1蛋白，CFP1是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶Set1的指南針，使啟動(dòng)子特異性地富集了H3K4me3，使染色質(zhì)處于開(kāi)放狀態(tài)，標(biāo)志轉(zhuǎn)錄激活。因此可以推測(cè)CFP1與14-3-3蛋白通過(guò)NF-κB蛋白可能會(huì)影響胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移及侵襲能力等，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。CFP1可能會(huì)成為胃癌患者新的分子標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。
2.2CFP1與結(jié)直腸癌
結(jié)直腸癌(Colorectalcancer,CRC)是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，由于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞一系列遺傳和表觀遺傳改變的逐步積累，導(dǎo)致結(jié)直腸腺瘤和侵襲性腺癌的發(fā)生[23]。
相關(guān)研究報(bào)道，在60%~70%的大腸癌細(xì)胞中18q染色體缺失，表明該區(qū)域可能含有與大腸癌發(fā)生有關(guān)的抑癌基因(TSGs)[24]。盡管18q染色體缺失常影響染色體臂的大部分，但結(jié)腸癌基因(DCC)缺失的18q21染色體最小區(qū)域已被確定，在同一4mb染色體區(qū)域內(nèi)還存在甲基CpG結(jié)合蛋白1(MBD1)、甲基CpG結(jié)合蛋白2(MBD2)、CpG結(jié)合蛋白(CFP1)、sma和mad相關(guān)蛋白4(SMAD4)。為了探究該區(qū)域是否存在抑癌基因，Derks等[25]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中只有DCC基因啟動(dòng)子被高甲基化，導(dǎo)致表達(dá)沉默，而其它臨近基因MBD1、MBD2、CFP1、SMAD4不受影響。此外，Bader等[26]研究表明CFP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中突變率很低，常被認(rèn)為是與結(jié)腸癌發(fā)生無(wú)關(guān)的突變。綜上研究表明CFP1基因可能不是結(jié)直腸癌中潛在的抑癌基因，CFP1基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌中的作用有限。
2.3CFP1與肺癌
在全球范圍內(nèi)，肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道表觀遺傳改變?cè)诜伟┑陌l(fā)生發(fā)展中起重要作用，DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA表達(dá)在肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、評(píng)估預(yù)后和治療中具有重要意義[27]。
長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Longnon-codingRNAs,lncRNA)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[28]。Tao等[29]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌中l(wèi)ncRNAP53RRA表達(dá)下調(diào)，P53RRA可以與RNA結(jié)合蛋白(G3BP)結(jié)合，取代G3BP復(fù)合物中的P53，導(dǎo)致P53更多的保留在細(xì)胞核中，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤進(jìn)展，發(fā)揮抑癌作用。Mao等[30]通過(guò)對(duì)比肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，CFP1在癌細(xì)胞中與未甲基化的CpG島結(jié)合力降低，導(dǎo)致癌細(xì)胞P53RRA蛋白轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)H3K4me3降低、H3K27me3顯著升高，抑制P53RRA蛋白表達(dá)。在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)CFP1過(guò)表達(dá)會(huì)增加P53RRA的表達(dá)水平，發(fā)揮抑癌作用。
有研究表明肺泡巨噬細(xì)胞在肺癌早期起識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞的作用，隨著腫瘤發(fā)展又在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用[31]。Hui等[32]研究發(fā)現(xiàn)CFP1缺失會(huì)導(dǎo)致粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的受體亞基Csf2rα基因啟動(dòng)子區(qū)H3K4的修飾減少，導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌活性降低。小鼠缺乏CFP1容易受到細(xì)菌感染，在小鼠肺組織表現(xiàn)出自發(fā)的炎癥癥狀，包括炎癥細(xì)胞的侵潤(rùn)和表面活性磷脂蛋白的積累。恢復(fù)Csf2rα的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肺泡巨噬細(xì)胞活性。肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，適度的刺激CFP1蛋白的表達(dá)可能是治療肺癌的潛在靶點(diǎn)，但尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。
2.4CFP1與膠質(zhì)瘤
膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦瘤，以治療耐藥而聞名。在過(guò)去的十年中，表觀調(diào)控基因的突變被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。在成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致的DNA修復(fù)基因MGMT表觀遺傳沉默可以預(yù)測(cè)烷基化劑治療的療效。這些表觀遺傳改變被用作生物標(biāo)記，并在膠質(zhì)瘤的分類和治療決定中發(fā)揮核心作用[33]。
Bronner等[34]研究發(fā)現(xiàn)CFP1對(duì)DNA甲基化修飾是通過(guò)與DNMT1相互作用實(shí)現(xiàn)的，抑制CFP1表達(dá)后DNMT1活性明顯降低，而DNMT3a、DNMT3b活性無(wú)明顯變化。DNA甲基化是基因組的一個(gè)生物學(xué)過(guò)程，DNMT水平升高而引起啟動(dòng)子和其他調(diào)控區(qū)域的局部高甲基化，從而使腫瘤抑制基因沉默，因此有研究者提出DNMT抑制劑是表觀遺傳藥物開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)，可能為膠質(zhì)瘤治療耐藥患者提供新的治療方案[35]。
相關(guān)期刊推薦：《中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志》ChineseJournalofComparativeMedicine(月刊)1991年創(chuàng)刊，國(guó)家級(jí)學(xué)術(shù)期刊。主要刊載有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的理論專著、科研成果論文、科學(xué)實(shí)驗(yàn)新方法、新材料、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新資源開(kāi)發(fā)、新的動(dòng)物品系的培育和應(yīng)用以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)的其他學(xué)科的科學(xué)論述。讀者對(duì)象：農(nóng)牧漁業(yè)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)保、生物、體育、國(guó)防等單位的科技工作者、管理人員以及有關(guān)的生產(chǎn)者、大專院校學(xué)生等。
有研究表明DNMT1可能與癌基因或抑癌基因的沉默有關(guān)，DNMT抑制劑的最初目的是促進(jìn)被DNA高甲基化的抑癌基因重新激活，而不促進(jìn)其它癌基因的激活，因此理想的DNMT抑制劑需要靶向特定的DNMT復(fù)合物[36]。Cheray等[37]實(shí)驗(yàn)表明DNMT1/USP7、DNMT1/Cfp1、DNMT1/Stat3復(fù)合物在腦、乳腺和肺腫瘤中表達(dá)明顯增加。通過(guò)將U251細(xì)胞皮下注射到小鼠體內(nèi)，然后使用替莫唑胺(TMZ)和針對(duì)三種復(fù)合物的抑制劑治療，結(jié)果表明，TMZ和DNMT1/CFP1抑制劑治療組，TMZ抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞的死亡百分比明顯增加，腫瘤的生長(zhǎng)效率明顯降低。異種移植建立體內(nèi)膠質(zhì)瘤模型實(shí)驗(yàn)表明特異性抑制DNMT1/CFP1復(fù)合物同樣增加了膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡的百分比，具有提高抗腫瘤療效的作用。說(shuō)明抑制CFP1與DNMT1的相互作用可以提高化療藥物TMZ的效果，但具體機(jī)制還有待于研究。
2.5CFP1與MLL白血病
混合譜系白血病(mixedlineageleukemia.MLL)是一類惡性程度高、預(yù)后差的難治性急性白血病，因此急需開(kāi)發(fā)特定的靶向治療。MLL基因由急性白血病的染色體異位產(chǎn)生，編碼產(chǎn)生白血病的MLL融合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Hoxa9基因的表達(dá)對(duì)急性白血病的發(fā)生有促進(jìn)作用，而MLL融合蛋白的結(jié)構(gòu)域中含有與DNA結(jié)合的CXXC結(jié)構(gòu)域，能夠與未甲基化的DNA結(jié)合，使Hoxa9基因位點(diǎn)的CpG殘基和組蛋白H3K9不發(fā)生甲基化，促進(jìn)Hoxa9基因的表達(dá)[38,-39]。
Risner等[40]尋找是否存在類似的MLLCXXC結(jié)構(gòu)域，進(jìn)行替換，以期尋找新的治療靶點(diǎn)，研究者選擇了DNMT1、MBD1、CFP1三種蛋白中的CXXC結(jié)構(gòu)域，用以替換MLL融合蛋白的CXXC結(jié)構(gòu)域。首先比較與未甲基化DNA結(jié)合的親和力，結(jié)果：MLLCXXC結(jié)構(gòu)域與未甲基化的DNA親和力最強(qiáng)，CFP1CXXC結(jié)構(gòu)域與未甲基化的DNA親和力比MLLCXXC結(jié)構(gòu)域低7倍。DNMT1CXXC結(jié)構(gòu)域比MLLCXXC結(jié)構(gòu)域低34.4倍，而MBD1CXXC結(jié)構(gòu)域與未甲基化的DNA無(wú)親和力。在骨髓集落復(fù)制實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)白血病實(shí)驗(yàn)表明只有DNMT1CXXC結(jié)構(gòu)域能夠功能性替代MLLCXXC結(jié)構(gòu)域，使Hoxa9基因位點(diǎn)的CpG殘基和組蛋白H3K9不發(fā)生甲基化。雖然初步研究表明MLL白血病中CFP1CXXC結(jié)構(gòu)域不能功能性代替MLLCXXC結(jié)構(gòu)域，但是能否通過(guò)CFP1調(diào)控DNMT1用于治療白血病仍值得進(jìn)一步探索。
Young等[41]研究發(fā)現(xiàn)，人類PLB-985細(xì)胞(人急性髓系白血病細(xì)胞)的正常增值分化需要CFP1蛋白。敲除CFP1基因?qū)е录?xì)胞存活率降低約50%，倍增時(shí)間延長(zhǎng)，并且不能向單核細(xì)胞及粒細(xì)胞分化。由此可見(jiàn)CFP1蛋白是PLB-985細(xì)胞生存、增殖、分化的必要蛋白，能否通過(guò)調(diào)控CFP1基因的表達(dá)來(lái)治療白血病值得進(jìn)一步研究探索。
3小結(jié)及展望
綜上研究表明，CFP1主要調(diào)控DNMT1和H3K4me3以外，還存在其它調(diào)節(jié)通路，參與表觀遺傳修飾，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、治療及不良預(yù)后密切相關(guān)，但其復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制研究以及大樣本隊(duì)列研究加速其在臨床中的應(yīng)用仍處于初級(jí)階段，亟待進(jìn)一步的探索研究。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，CFP1在臨床方面的研究會(huì)越來(lái)越深入，期望CFP1在惡性腫瘤診斷、治療及預(yù)后中成為新的突破點(diǎn)。——論文作者：王東升，穆思宇，王健崗，謝龍飛，鐘翔宇
