發(fā)布時(shí)間：2020-04-14所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，CS)作為一種具有天然活性的酸性粘多糖類物質(zhì)，廣泛的存在于動(dòng)物組織，尤其是軟骨和結(jié)締組織中。不同動(dòng)物來源的Cs種類和數(shù)量各不相同造就了CS生物活性的多樣性，隨著對(duì)CS功能性質(zhì)的研究和應(yīng)用的不斷深入，CS被廣泛的應(yīng)用于保
硫酸軟骨素(chondroitinsulfate，CS)作為一種具有天然活性的酸性粘多糖類物質(zhì)，廣泛的存在于動(dòng)物組織，尤其是軟骨和結(jié)締組織中。不同動(dòng)物來源的Cs種類和數(shù)量各不相同造就了CS生物活性的多樣性，隨著對(duì)CS功能性質(zhì)的研究和應(yīng)用的不斷深入，CS被廣泛的應(yīng)用于保健食品、藥品和臨床中。目前，由于原料來源、生產(chǎn)工藝以及使用的測(cè)定方法不同，許多文獻(xiàn)報(bào)道的cs的產(chǎn)率和純度差別很大，使得cS的質(zhì)量很難控制，因此，CS的含量測(cè)定在檢驗(yàn)生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制等方面的作用也越來越重要。本文對(duì)目前常見的CS含量測(cè)定方法進(jìn)行梳理總結(jié)，以期為今后的科研和實(shí)際生產(chǎn)提供幫助。
1CS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
要想對(duì)CS的測(cè)定方法進(jìn)行研究就必需對(duì)CS的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有充分的了解。CS是EhD一葡萄糖醛酸(GlcA)和N一乙酰一D一氨基半乳糖(GalNAc)硫酸酯通過6—1，3糖苷鍵連接成為重復(fù)的二糖單位，二糖單位間通過B一1，4糖苷鍵聚合而成的一類大分子多糖。根據(jù)糖醛酸種類(葡萄糖醛酸GlcA/艾杜糖醛酸IdoA)以及氨基半乳糖上硫酸基取代位置(C一4/C一6)的不同，CS有許多同分異構(gòu)體¨J
2CS含量測(cè)定方法的研究進(jìn)展
CS的含量測(cè)定方法大致可以分為兩類，即直接測(cè)定和間接測(cè)定。直接測(cè)定不需對(duì)cS進(jìn)行分解處理，不需要轉(zhuǎn)換，直接測(cè)定CS本身含量，因此直接測(cè)定方法能更準(zhǔn)確的反應(yīng)CS的實(shí)際含量;而間接測(cè)定不是測(cè)定cs本身而是將cs轉(zhuǎn)化成其他便于測(cè)定的物質(zhì)從而確定其含量。但由于CS分子上各種成分與其二糖單位間的相關(guān)性不一致，各種操作方法的可操作性、耗時(shí)和準(zhǔn)確度等也不盡相同，因此在實(shí)際測(cè)定過程中要根據(jù)不同的方法進(jìn)行選擇。
2.1直接測(cè)定方法
由于cs為聚陰離子，因此以CS中的陰性集團(tuán)作為反應(yīng)指示物的直接測(cè)定方法有陽離子染色法、CPC法、電化學(xué)法、色譜法等。
2.1.1陽離子染色法
帶正電的陽離子染料與CS的硫酸基和羧基生成復(fù)合物，導(dǎo)致染料本身的吸光度發(fā)生變化，根據(jù)反應(yīng)前后吸光度的變化從而測(cè)定CS的含量。
陽離子染料的種類很多，使用不同的染料其具體測(cè)定方法也略有不同，適用范圍也不同。高貴珍等用天青A對(duì)CS進(jìn)行染色，在625nm波長處測(cè)定了中藥復(fù)方制劑中CS的含量。由于天青A對(duì)不同的黏多糖選擇性不強(qiáng)，測(cè)定結(jié)果容易受其他黏多糖的影響。Pospichal等通過CS與天青B反應(yīng)，用流動(dòng)注射分析法以分光光度檢測(cè)器測(cè)定了cs含量，并分別在靜態(tài)及流動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行了研究j。施文健等用堿性艷藍(lán)BO對(duì)cs進(jìn)行染色，在570nln波長處測(cè)定了Cs含量，這種方法簡便、快速、準(zhǔn)確，但是對(duì)反應(yīng)條件要求比較高，不易控制J。Li等將cs—A與結(jié)晶紫相互作用生成復(fù)合物，其RRS光譜比CS—A及結(jié)晶紫的RRS光譜明顯增強(qiáng)。其復(fù)合物在328nm波長處產(chǎn)生新的散射光譜，檢測(cè)了cS—A注射液及CS樣品中痕量的CS—A，此法適用于痕量的CS檢測(cè)，在實(shí)際測(cè)定中其使用范圍受到一定限制J。
陽離子染色法所用的染料不同，測(cè)定時(shí)所需的條件不同，染料和CS結(jié)合的特異性和緊密性也不同，因此這種方法雖然比較簡單、設(shè)備要求不高，但是受不同染料的影響其準(zhǔn)確性也不一樣，需要根據(jù)實(shí)際測(cè)定的需要進(jìn)行選擇。
2.1.2CPC法
CPC法是美國藥典規(guī)定的CS的含量檢測(cè)方法。美國藥典一處方集(USP—NF)CS含量測(cè)定法依據(jù)CS為聚陰離子，可與氯化十六烷基吡啶(CPC)作用生成難溶物，適宜條件下形成穩(wěn)定的混懸液，與已知濃度的CS溶液比較混懸液的透光度，可知檢測(cè)CS的含量。
姬勝利等報(bào)道了用CPC法在680nm處測(cè)定cs吸光度的變化從而測(cè)定CS的含量，不需要特殊的儀器，操作簡便。鐘明亮等報(bào)道了用光度滴定法測(cè)定Cosequin@DS咀嚼片中的CS—Na的方法，用0.1%(w/v)CPC滴定CS—Na并在420nm下用比色計(jì)指示光度變化，比色計(jì)顯示最大反應(yīng)時(shí)即為終點(diǎn)，在選定的濃度范圍內(nèi)(0.6～1.4rag/mL)CS—Na標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性(r>10.99)，這種方法有針對(duì)性，良好的線性，準(zhǔn)確度和精確度，非常適合原材料和Cosequin~DS咀嚼片中的cS—Na的定量測(cè)定，不需酶解酸解，直接測(cè)定，快速準(zhǔn)確，4～5min/樣】。劉坤等報(bào)道了用CPC法快速測(cè)定Cs含量的方法，在波長680nm處測(cè)定CS在0～625g/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r：0.998，方法回收率為98.49%，RSD為1.11%。該測(cè)定方法與氨基己糖法相比簡便快速，重現(xiàn)性好J。張關(guān)順報(bào)道了將cS對(duì)照品用水溶解，加入pH值7.2磷酸鹽緩沖溶液5mL，定容后用CPC滴定，以電位指示終點(diǎn)，求得校正因子，再用同法測(cè)樣品，計(jì)算含量。這種方法更簡便，不用空白，但對(duì)電壓的穩(wěn)定性要求較高。劉憲鋒等在報(bào)道膜技術(shù)在CS生產(chǎn)上的應(yīng)用中使用CPC滴定儀測(cè)定cs含量，更為便捷…。
這種方法相對(duì)來說比較穩(wěn)定，結(jié)合儀器進(jìn)行測(cè)定方便快捷，準(zhǔn)確性也較高，目前已經(jīng)得到國內(nèi)外的認(rèn)可。
2.1.3電化學(xué)法
Sun等用派洛寧B作電化學(xué)探針測(cè)定了CS含量。將cS加至派洛寧B溶液中，線性掃描伏安還原峰電勢(shì)無變化但電流明顯降低，電流降低與濃度呈線性關(guān)系。沈建如等利用高效毛細(xì)管電泳測(cè)定原料藥及片劑中cS含量，Cs在0.04—2.02g/mL的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.9998)，平均回收率為100.2%，該法快速、簡單、準(zhǔn)確，可用于原料藥及片劑中cS的含量測(cè)定¨。
電位法操作簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，雜質(zhì)不干擾測(cè)定，實(shí)際操作中對(duì)測(cè)定條件如對(duì)電壓穩(wěn)定性要求高，在穩(wěn)壓穩(wěn)流的情況下可得到滿意結(jié)果。
2.1.4液相色譜法
趙振鋒等采用高效液相色譜法對(duì)cs進(jìn)行直接分析，結(jié)果表明CS在1.742～8.71mg/mL濃度范圍內(nèi)同峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.9998)，具有較好的重現(xiàn)性，此方法具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)14]。潘自國等在209nm波長處測(cè)定了CS總量，不但能直接測(cè)定CS的總量，同時(shí)還能測(cè)定了A、B、C、D等4種異構(gòu)體的含量¨。
液相色譜法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，解決了蔗糖等還原糖對(duì)含量測(cè)定的干擾，但其基線噪音高，不穩(wěn)定，儀器平衡時(shí)間長，常有色譜峰拖尾，結(jié)果變異大，難以控制，而且CS相對(duì)分子量范圍較廣，不易選擇合適的對(duì)照品。對(duì)儀器和試劑要求高，一些色譜方法需要專業(yè)的軟骨素酶，價(jià)格昂貴，操作繁瑣;有些需要有毒試劑，造成操作的不便，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)需要進(jìn)行選擇。
2.2間接測(cè)定方法
間接測(cè)定方法是從CS的分子結(jié)構(gòu)人手，將CS轉(zhuǎn)化分解為便于測(cè)定的結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行測(cè)定，常用于測(cè)定的結(jié)構(gòu)單元主要有：氨基己糖、葡萄糖醛酸、二糖單元和硫酸根等。
2.2.1氨基己糖
最早的關(guān)于CS測(cè)定的方法就是Elson—Morgan，目前我國藥品標(biāo)準(zhǔn)采用Elson—Morgan法測(cè)定cs含量，根據(jù)CS水解所得氨基葡萄糖與乙酰丙酮發(fā)生縮合反應(yīng)，其產(chǎn)物與對(duì)二甲氨基苯甲醛的酸醇溶液呈紅色，測(cè)定525nm波長處吸光度。該方法操作繁瑣，重現(xiàn)性差，謝繼青等通過析因?qū)嶒?yàn)分析認(rèn)為影響測(cè)定的主要因素是乙酰化和顯色，對(duì)該方法進(jìn)行了優(yōu)化，增加了測(cè)定的精密度和重現(xiàn)性。李萍等對(duì)測(cè)定的時(shí)間條件進(jìn)行了研究，分析時(shí)間比原方法縮短一半以上。
2.2.2葡萄糖醛酸
cs在酸性條件生成糠醛或其衍生物，與問苯三酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)物在554nm波長處有最大吸收。高華等用問苯三酚分光光度法對(duì)CS的測(cè)定進(jìn)行了研究，在0.1～1.0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.993)，具有良好的重現(xiàn)性。張華瑤等進(jìn)行了操作條件的優(yōu)化，并測(cè)定了角膜寧滴眼液中cs含量。cs中的葡糖醛酸在硫酸的作用下生成糠醛，在咔唑的醇溶液中顯紅色，在520nm波長處有最大吸收。該法較測(cè)定氨基葡糖法簡單一些，但由于在操作過程中有濃硫酸，所以給實(shí)際操作帶來諸多不便。翟詠紅等用該法測(cè)定了真靈活膠囊(復(fù)方制劑)中CS的含量，制劑中的氨基葡萄糖對(duì)CS測(cè)定無干擾。4一氨基一3一肼基一5一巰基一1，2，4一三唑(AH.MT)作為顯色劑，與己糖醛酸或CS顯色靈敏。AH.MT在堿性溶液中與CS生成紫色衍生物，在540nm波長處測(cè)定吸光度可測(cè)定cs的含量J。劉坤等利用該法測(cè)定了軟骨魚類中CS的含量，并優(yōu)化了測(cè)定條件。
2.2.3二糖單元
軟骨素二糖的含量通常可采用高效液相色譜法、酶解一高效液相色譜法、反相離子對(duì)高效液相色譜法和反相高效液相色譜法測(cè)定。HitoshiOkamoto等報(bào)道了將CS用酶水解成為硫酸軟骨二糖，然后用毛細(xì)管酶反應(yīng)測(cè)定其含量從而建立在線分析系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)內(nèi)使用電泳遷移將酶混合物和底物Cs混合，然后在一個(gè)微弱的電場里面繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，最后在外加電場的作用下反應(yīng)的產(chǎn)物遷移到檢測(cè)器。為了減少蛋白質(zhì)的吸附，使用一個(gè)聚氯乙烯酒精涂抹的毛細(xì)管。在反極性作用下，二糖成功的遷移到10mMTris—acetatebuffer(pH值7.0)的陽極，在232nm下檢測(cè)。這種方法應(yīng)用于滴眼液的檢測(cè)，不受輔料的干擾。線性良好(r≥0.999)，回收率100.0%～100.5%，精確度0.2%～0.6%(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)。精密、操作簡便、安全、快速、自動(dòng)化，酶用量比HPLCCE少。
2.2.4硫酸根
茅力等用離子色譜法將Cs水解成等摩爾的硫酸根。用離子色譜柱將硫酸根和其他雜質(zhì)分離后以電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。測(cè)定了CS原料、注射液和鯊魚軟骨粉中cs含量_2。后來他們又用原子吸收光譜法將鯊魚軟骨粉水解后，加入已知量的鋇離子使硫酸根沉淀。將樣品用水浸泡后做浸泡對(duì)照。用原子吸收光譜法測(cè)得游離硫酸根，從而算出水解出的有機(jī)硫酸根的量，再換算出CS含量J。
以上這幾種方法都是以cS的結(jié)構(gòu)單元的一部分作為測(cè)定的基準(zhǔn)物質(zhì)，原理上相同，一般先將CS進(jìn)行水解，徹底分解為單體，然后再進(jìn)行衍生化顯色反應(yīng)。對(duì)儀器要求不高，準(zhǔn)確度較高。但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，干擾因素多，重復(fù)性差，一些衍生物往往還具有一定的毒性，目前在這方面的研究主要是對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到提高準(zhǔn)確性，簡便性，縮短反應(yīng)時(shí)間。
3結(jié)論
從以上對(duì)各種方法的總結(jié)我們可以發(fā)現(xiàn)，不同方法有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際測(cè)定中應(yīng)該根據(jù)實(shí)際條件和對(duì)結(jié)果的要求不同選擇不同的方法。不同來源，不同生產(chǎn)工藝的CS在含量和結(jié)構(gòu)方面都不相同，而目前文獻(xiàn)報(bào)道的CS的產(chǎn)率和純度差別很大，隨著全球市場CS需求量的增大，CS在保健品和臨床中的應(yīng)用越來越廣泛，不同的產(chǎn)品CS含量也有差別，也需要對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行含量鑒定，所以CS含量測(cè)定方法不論在生產(chǎn)過程還是產(chǎn)品的質(zhì)量控制過程中的作用也越來越重要。因此研究簡便、便宜、快速、精確、安全、穩(wěn)定、重復(fù)性好的方法依然是未來發(fā)展的去勢(shì)。
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