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摘 要： 【摘要】毛細(xì)管電泳是一種新型的分析技術(shù)，具有高柱效、高選擇性、快速分離、低溶劑消耗、分離模式多等特點(diǎn)。其應(yīng)用涉及到分析領(lǐng)域的各個(gè)方面，尤其對(duì)藥物的分析有著特有的貢獻(xiàn)。頭孢類(lèi)抗生素作為抗生素的重要分支，一直以來(lái)是藥物分析的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。本
【摘要】毛細(xì)管電泳是一種新型的分析技術(shù)，具有高柱效、高選擇性、快速分離、低溶劑消耗、分離模式多等特點(diǎn)。其應(yīng)用涉及到分析領(lǐng)域的各個(gè)方面，尤其對(duì)藥物的分析有著特有的貢獻(xiàn)。頭孢類(lèi)抗生素作為抗生素的重要分支，一直以來(lái)是藥物分析的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。本文選取十種頭孢類(lèi)抗生素或前體為供試樣品，以CZE模式，檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm，緩沖液為40mmol/L磷酸鹽(Na2HPO4+NaH2PO4，pH為7.0)，總柱長(zhǎng)為65cm，有效柱長(zhǎng)為45cm，柱內(nèi)徑50μm，分離電壓為-15kV，重力進(jìn)樣，以此建立了一種高效毛細(xì)管電泳的分析方法并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法表明，十種供試樣品可在20分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。本方法簡(jiǎn)單有效，為頭孢類(lèi)抗生素類(lèi)抗生素的分離分析提供了一種新的借鑒模式。
【關(guān)鍵詞】毛細(xì)管電泳，頭孢類(lèi)抗生素，方法開(kāi)發(fā)
毛細(xì)管電泳，又叫高效毛細(xì)管電泳(HPCE)，是八十年代問(wèn)世的一種高效的液相分離方法，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物，它已成為分析化學(xué)新興的一個(gè)分支學(xué)科[1]。毛細(xì)管電泳具有分析時(shí)間短，分離效率高，溶劑消耗少的特點(diǎn)。柱的效率通常達(dá)到105～107理論塔板/米。毛細(xì)管電泳有六種不同的分離形式：毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜(MEKC)、毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)、毛細(xì)管快速電泳(CITF)以及毛細(xì)管電色譜(CEC)模式等。CZE是毛細(xì)管電泳中使用最廣泛，最基本的分離方式。其應(yīng)用包括無(wú)機(jī)離子，小分子氨基酸、多肽以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)。此外，通過(guò)向緩沖溶液中加入手性添加劑，一些對(duì)映體也能夠被分離。頭孢菌素類(lèi)抗生素的pKa一般在2～5，當(dāng)緩沖溶液的pH值大于5時(shí)，這些頭孢菌素類(lèi)抗生素化合物將帶負(fù)電。因此，頭孢類(lèi)抗生素可以通過(guò)高效毛細(xì)管電泳來(lái)分離。本實(shí)驗(yàn)選取十種頭孢類(lèi)抗生素或前體作為供試樣品，通過(guò)對(duì)毛細(xì)管電泳條件的優(yōu)化，建立了分析頭孢菌素抗生素的高效毛細(xì)管電泳的分離方法并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。
1 儀器與試劑
1.1儀器
CE：型號(hào)CE-1000，UnimicroTechnologies生產(chǎn)。pH計(jì)：型號(hào)PB-10，北京賽多利斯儀器有限公司生產(chǎn)。超聲波清洗器：型號(hào)KQ2200B，昆山超聲儀器有限公司生產(chǎn)。電子天平：型號(hào)FA1004，上海恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。紫外分光光度計(jì)：型號(hào)LAMBDA25，PekinElmer生產(chǎn)
1.2試劑
純化水：UnimicroTechnologies臨用新制。甲醇：級(jí)別HPLC，SCRC生產(chǎn)。Na2HPO4：級(jí)別AR，SCRC生產(chǎn)。NaH2PO4：級(jí)別AR，SCRC生產(chǎn)。乙腈：級(jí)別HPLC，Merck生產(chǎn)。
1.3實(shí)驗(yàn)對(duì)照品
所有實(shí)驗(yàn)對(duì)照品均來(lái)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院，開(kāi)瓶有效期均為2018年12月10日，所有對(duì)照品均為2～8℃保存。頭孢克肟(含量：100%，批號(hào)：130503-201706)頭孢氨芐(含量：100%，批號(hào)：130408-201411)，7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(含量：100%，批號(hào)：130416-201006)，頭孢呋辛(含量：100%，批號(hào)：130493-201706)，7-氨基頭孢烷酸(含量：100%，批號(hào)：130538-200902)，頭孢哌酮(含量：93.8%，批號(hào)：130420-201105，頭孢他啶(含量：100%，批號(hào)：130484-201205)，頭孢吡肟(含量：100%，批號(hào)：130524-201404)，頭孢噻肟(含量：92.2%，批號(hào)：130483-201505)，頭孢拉定(含量：88.4%，批號(hào)：130427-201708)。
2 頭孢類(lèi)抗生素的高效毛細(xì)管電泳分離方法的建立
2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
取實(shí)驗(yàn)對(duì)照品，分別配制成含各成分均約10μg/mL的紫外掃描溶液，分別于190～500nm下做紫外掃描，得出全波長(zhǎng)掃描圖譜。依照毛細(xì)管電泳波長(zhǎng)選擇的原則，在基質(zhì)不干擾的情況下取最大靈敏度的波長(zhǎng)，故選擇195nm為測(cè)試波長(zhǎng)。
2.2緩沖液的選擇
根據(jù)各化合物的理化性質(zhì)，頭孢拉定pKa1(2.63)，頭孢氨芐的pKa1=5.2以及其他的化合物的總pKa值范圍在1.62～5.2，并存在一定的梯度。從pKa與pH的關(guān)系考慮，若化合物能得到良好的分離，即是說(shuō)明pH至少為6.8以上。磷酸鹽緩沖6.2～8.2，故選擇磷酸鹽緩沖液。緩沖液以Na2HPO4+NaH2PO4配制方式最容易重現(xiàn)。電滲流從pH=8開(kāi)始下降。此時(shí)會(huì)使分析時(shí)間加長(zhǎng)。再者頭孢類(lèi)在堿性條件中的穩(wěn)定性不佳，故pH選擇范圍初步設(shè)定為6.8～8。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH=7.0時(shí)分離效果最好。
2.3緩沖液濃度的選擇
緩沖液濃度對(duì)峰形和出峰時(shí)間有較大影響。選擇磷酸鹽緩沖液濃度分別為30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L對(duì)方法進(jìn)行考察。選擇40mmol/L的濃度，因其可以達(dá)到更為理想的分離度，且分離時(shí)間在20min以?xún)?nèi)。
2.4毛細(xì)管長(zhǎng)及內(nèi)徑
為調(diào)整分離度增加柱長(zhǎng)是有限度的。本次實(shí)驗(yàn)選擇三個(gè)柱長(zhǎng)，分別是柱長(zhǎng)1：總長(zhǎng)為70cm(其中有效長(zhǎng)度為50cm)，柱長(zhǎng)2：總長(zhǎng)為=65cm(其中有效長(zhǎng)度為50cm)，柱長(zhǎng)3：總長(zhǎng)為65cm(其中有效長(zhǎng)度為45cm)。其中柱長(zhǎng)3能達(dá)到更加理想的分離度，效果明顯好于其他柱長(zhǎng)。
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不同內(nèi)徑大小的毛細(xì)管會(huì)對(duì)分析物的分離產(chǎn)生一定的影響，本實(shí)驗(yàn)分別考察50μm和75μm的毛細(xì)管柱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)徑為50μm的毛細(xì)管的柱效要比內(nèi)徑為75μm的高，供試樣品能夠在在20分鐘以?xún)?nèi)得到基線分離，因此，我們選取50μm內(nèi)徑的毛細(xì)管。
2.5電壓的選擇
在一定范圍內(nèi)，增加分離電壓可以改善相鄰組分間的分離，而焦耳熱限制了過(guò)高電壓的使用。這里考察-15kV和-20kV的電壓。-15kV耗能少，操作安全，焦耳熱明顯少于-20kV。
故綜合2.1～2.5，最優(yōu)化的分離條件是在CZE模式下，檢測(cè)波長(zhǎng)195nm，緩沖液為40mmol/L磷酸鹽(Na2HPO4+NaH2PO4)，pH7.0，柱長(zhǎng)65cm(其中有效柱長(zhǎng)為45cm)，柱內(nèi)徑50μm，分離電壓-15kV。分離效果見(jiàn)圖1。
3 頭孢類(lèi)抗生素的高效毛細(xì)管電泳分離方法的驗(yàn)證
3.1線性
配制10種頭孢類(lèi)抗生素對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液，使其濃度分別為100.0µg/mL。取該溶液逐步稀釋?zhuān)♂屪罱K線性濃度為六個(gè)級(jí)別：化合物L(fēng)OQ，濃度1:3.0µg/mL，濃度2:4.0µg/mL，濃度3:5.0µg/mL，濃度4:10.0µg/mL，濃度5:20.0µg/mL。
在經(jīng)優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行測(cè)試，得到一系列響應(yīng)的數(shù)據(jù)，繪制校準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程和檢測(cè)限。見(jiàn)表1。
3.2精密度實(shí)驗(yàn)取
3.1中的濃度3(5.0µg/mL)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6針，考察各化合物的峰面積及遷移時(shí)間RSD。
峰面積RSD結(jié)果：頭孢克肟、頭孢氨芐、7-ADCA、頭孢呋辛、7-ACA、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢拉定依次分別為8.60%、7.60%、6.50%、5.90%、9.70%、6.30%、7.30%、6.80%、5.40%、7.30%。
遷移時(shí)間RSD結(jié)果：頭孢克肟、頭孢氨芐、7-ADCA、頭孢呋辛、7-ACA、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢拉定依次分別為2.60%、2.40%、1.20%、2.50%、2.30%、2.00%、2.60%、2.80%、2.60%、2.70%。
結(jié)果顯示，所有化合物的峰面積RSD在5.4%～9.7%，遷移時(shí)間的RSD在1.2%～2.8%。說(shuō)明該方法完全滿(mǎn)足CE方法驗(yàn)證的要求，即遷移時(shí)間RSD小于3%，峰面積RSD小于10%。
4 結(jié) 論
本文在仔細(xì)研究了十種目標(biāo)物的理化性質(zhì)后，確認(rèn)了毛細(xì)管電泳可分離分析十種頭孢類(lèi)抗生素，并隨即成功開(kāi)發(fā)了一套耗時(shí)短、操作方便快捷、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的頭孢類(lèi)抗生素的分析方法并成功驗(yàn)證。該方法分離時(shí)間短且峰形良好，各組分能夠被基線分離。方法驗(yàn)證結(jié)果說(shuō)明，各組分線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.990;在平行進(jìn)樣六針下，遷移時(shí)間的RSD均小于3.0%，峰面積的RSD均小于10%。此外，該方法的檢測(cè)限和定量限也滿(mǎn)足樣品檢測(cè)的需求。
