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摘 要： 摘 要：運(yùn)用實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)，分析 1 只臨床死亡小熊貓胃腸道 13 種菌群的差異性。結(jié)果顯示：檢測的 13 種菌群在小熊貓不同腸段的數(shù)量有差異，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在各腸段的菌群豐度差異顯著 (P0.05)，其菌群豐度在空腸高達(dá) 9.35;白色瘤胃球
摘 要：運(yùn)用實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)，分析 1 只臨床死亡小熊貓胃腸道 13 種菌群的差異性。結(jié)果顯示：檢測的 13 種菌群在小熊貓不同腸段的數(shù)量有差異，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在各腸段的菌群豐度差異顯著 (P<0.05)，其菌群豐度在空腸高達(dá) 9.35;白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)和黃色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的數(shù)量在直腸最多，菌群豐度分別達(dá) 5.29 和 3.91;其他菌群的數(shù)量均在結(jié)腸最多，其中溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)和梭菌類群 IV(Clostridium cluster IV)的數(shù)量在結(jié)腸中較高，菌群豐度分別為 9.03、6.06 和 9.13;與胃相比，菌群豐度在小熊貓空腸、結(jié)腸和直腸差異顯著(P<0.05)。綜合分析，小熊貓的空腸、結(jié)腸和直腸對其健康生長可能起著重要的作用，腸桿菌科的細(xì)菌數(shù)量最多且在不同腸段差異顯著，是今后小熊貓胃腸道菌群研究值得關(guān)注的菌群之一。
關(guān) 鍵 詞： 小熊貓;胃;腸;菌群;實(shí)時熒光定量 PCR
小熊貓(Ailrusus fulgens)又叫紅熊貓，是一種珍稀野生動物。2015 年，小熊貓被國際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列為瀕危物種，其種群多分布于中國、印度、尼泊爾、緬甸和不丹等地[1]。近年來，小熊貓數(shù)量呈逐漸下降趨勢。小熊貓是食肉目中以纖維飲食為主的哺乳動物，與大熊貓一樣都喜食箭竹的竹筍、嫩枝和竹葉等。近年來，研究者應(yīng)用比較基因組技術(shù)比較了小熊貓和大熊貓的全基因組，發(fā)現(xiàn)二者雖然親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但都有一種能幫助它們進(jìn)食的偽拇指和具有與竹子進(jìn)化相似的相關(guān)基因 PCNT 和 DYNC2H[2–3]。與大熊貓相似，小熊貓無盲腸，其胃腸道具有對食物進(jìn)行簡單發(fā)酵的作用;但它的代謝率卻與其體型相近的哺乳動物相似，可以滿足自身健康生長需要[4–5]。胃腸道是哺乳動物消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要部位，其中的微生物在宿主對食物的消化吸收方面起著重要的作用。
近年來，已有研究者對小熊貓的糞便微生物進(jìn)行了相關(guān)報道[6–8]。對小熊貓腸道微生物的研究也已成為科研人員研究的重點(diǎn)[9]，但目前仍鮮見對小熊貓整個胃腸道微生物的研究報道。本課題組已分別應(yīng)用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術(shù)和基于 16S rRNA 的 Illumina HiSeq 高通量測序技術(shù)，分析了 1 只臨床死亡小熊貓的胃腸道微生物[10–11]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其胃腸道中棲息著數(shù)量巨大且種類不同的微生物，以變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌為主，且來自變形菌門的腸桿菌科(Enterobacteriaceae) 菌群的豐度較高。盡管 DGGE 技術(shù)能直觀地展示小熊貓胃腸道菌群的多樣性，且能在一定程度上對亮度較高的條帶進(jìn)行克隆測序及獲得該菌種的名稱信息;而基于 16S rRNA 的 Illumina HiSeq 高通量測序技術(shù)可獲得大量的菌群注釋和豐度信息，但這 2 種技術(shù)均不是有針對性地對胃腸道特定菌群進(jìn)行定量和分析。基于 PCR 擴(kuò)增的實(shí)時熒光定量 PCR(Q–PCR) 技術(shù)則具有高靈敏性、高特異性和高準(zhǔn)確度等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于動物腸道特定菌群的檢測。鑒于此，本研究擬采用 Q–PCR 技術(shù)，分析 1 只臨床死亡小熊貓胃、小腸、大腸和糞便中的優(yōu)勢菌科、纖維降解菌和腸道益生菌等 13 種菌群，旨在為小熊貓的飼養(yǎng)管理與保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。
1 材料和方法
1.1 小熊貓胃腸道樣品
2016 年 7 月，四川省成都動物園 1 只小熊貓因打架導(dǎo)致斷尾，臨床外敷治療無效后死亡。于小熊貓死亡當(dāng)天即行剖檢，收集其胃腸道樣品。采樣部位包括胃、小腸(十二指腸、空腸和回腸)和大腸(結(jié)腸、直腸)。同時，收集 3 只同圈舍小熊貓糞便樣品，混合均勻后作為小熊貓的糞便樣品。所有樣品分別收集至無菌離心管，并立即放置液氮速凍，–80 ℃保存，備用。
1.2 主要試劑和儀器
主要試劑：QIAamp® DNA Stool Mini Kit 購自德國 Qiagen;瓊脂糖膠回收試劑盒、pMD®19–T 載體和大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自天根生化科技(北京)有限公司;13 對 Q–PCR 細(xì)菌引物合成自深圳華大基因有限公司;熒光定量成套試劑和材料購自美國 Bio–Rad。
相關(guān)期刊推薦：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)(雙月刊)于1951年創(chuàng)刊，曾用刊名：(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報)是農(nóng)林、水產(chǎn)、師范及綜合院校相關(guān)學(xué)科的師生、農(nóng)業(yè)科研和管理以及推廣人員的重要參閱文獻(xiàn)。有投稿需求的作者，可以直接與期刊天空在線編輯聯(lián)系。
主要儀器：核酸濃度檢測儀(NanoDrop® ND– 1000)購自美國 Wilmington;瓊脂糖凝膠電泳儀、凝膠成像儀和 CFX96 熒光定量 PCR 儀均購自美國 Bio–Rad;大容量高速臺式冷凍離心機(jī)購自美國 Thermo Fisher Scientific。
1.3 方法
1.3.1 細(xì)菌 DNA 的提取
分別稱取 0.20 g 樣品至 2 mL 滅菌 EP 管中，參照 QIAamp®DNA Stool Mini Kit 的說明書步驟進(jìn)行細(xì)菌 DNA 提取。為提高革蘭氏陽性細(xì)菌的提取率，在水浴步驟將溫度提高至 95 ℃，同時在最后一步加入 DNA 洗脫液后，將室溫孵育的時間由 1 min 延長至 3 min。DNA 濃度和純度用核酸蛋白檢測儀(NanoDrop®ND–1000)進(jìn)行檢測，最后將所有 DNA 置于–20 °C 冰箱保存。
1.3.2 細(xì)菌的實(shí)時熒光定量 PCR 檢測
使用 CFX96 熒光定量 PCR 儀分析小熊貓胃腸道的 13 種菌群，引物見表 1。對所有引物的特異性及熔解溫度(Tm 值)進(jìn)行檢測。PCR 反應(yīng)體系包括 1 μL 樣品 DNA、1 μL 上游引物、1 μL 下游引物、12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM II 和 9.5 μL ddH2O，并設(shè)置陰性對照。PCR 反應(yīng)程序：95 °C 預(yù)變性 5 min;95 °C 變性 15 s，55~95 °C 退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s，40 個循環(huán);所有 PCR 循環(huán)結(jié)束后 72 °C 延伸 5 min。最后在上述 PCR 反應(yīng)體系和程序條件下，用確定的 Tm值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對樣品進(jìn)行實(shí)時熒光定量檢測。每個樣品做 3 個重復(fù)。根據(jù)對應(yīng)的 Ct 值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計算胃腸道樣品細(xì)菌 DNA 的拷貝數(shù)[12]。菌群豐度以每克內(nèi)容物中 細(xì)菌 DNA 拷貝數(shù)的對數(shù)值表示。
1.3.3 數(shù)據(jù)處理
試驗結(jié)果用 Excel 2013 進(jìn)行統(tǒng)計和計算;采用 SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析;采用 GraphPad Prism 5 繪制菌群的柱狀圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 小熊貓胃腸道菌群的實(shí)時熒光定量 PCR 分析
供試小熊貓胃腸道中 13種菌群豐度的單因素方差分析結(jié)果(表 2)顯示，腸桿菌科、乳酸桿菌屬 (Lactobacillus spp.) 、 雙 歧 桿 菌 屬 (Bifidobacterium spp.)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、黃色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、溶纖維丁酸弧菌 (Butyrivibrio fibrisolvens) 、 埃 氏 巨 球 形 菌 (Megasphaera elsdenii)和梭菌類群 IV(Clostridium cluster IV)的豐度差異顯著(P<0.05);總細(xì)菌、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、普拉氏梭桿菌(Fusobacterium prausnitzii)和梭菌類群 XIVa(Clostridium cluster XIVa)的豐度差異不顯著(P>0.05)。各腸段豐度差異不顯著的菌群在結(jié)腸中數(shù)量最多，其中瘤胃球菌屬的豐度達(dá) 9.30，腸球菌屬的豐度為 9.23，普拉氏梭桿菌的豐度為 7.02，梭菌類群 XIVa 的豐度為 9.50;而豐度差異顯著菌群的豐度最高值出現(xiàn)在不同的腸段。對于大多數(shù)腸道菌群而言，結(jié)腸是宿主吸收營養(yǎng)物質(zhì)最重要的部位，大多數(shù)菌群在結(jié)腸的數(shù)量較多;而有些菌群需要在宿主其他的腸段發(fā)揮特定的作用，因而其數(shù)量在相應(yīng)的腸段較高。
2.2 小熊貓胃腸道差異菌群分析
與胃相比，腸桿菌科、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、埃氏巨球形菌和梭菌類群 IV 的豐度在各腸段顯示出一定的差異(圖 1)。其中，白色瘤胃球菌、埃氏巨球形菌和溶纖維丁酸弧菌的豐度在小熊貓的小腸、大腸和糞便中差異顯著(P<0.05);梭菌 類 群 IV 的 豐 度 在 小 腸 和 大 腸 中 差 異 顯 著 (P<0.05);黃色瘤胃球菌的豐度在十二指腸和大腸中差異顯著(P<0.05);乳酸桿菌屬的豐度在回腸、結(jié)腸和糞便中差異顯著(P<0.05);雙歧桿菌屬的豐度 在 空 腸 、 回 腸 、 結(jié) 腸 和 糞 便 中 差 異 顯 著 (P<0.05);而腸桿菌科的豐度在十二指腸、空腸、結(jié)腸、直腸和糞便中差異顯著(P<0.05)。乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬是哺乳動物腸道常見的益生菌，其豐度在小熊貓結(jié)腸較高;而與纖維飲食降解過程有著密切關(guān)系的菌群，如白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的豐度在直腸較高，溶纖維丁酸弧菌、埃氏巨球形菌和梭菌類群 IV 的豐度則在結(jié)腸中較高;腸桿菌科的菌群豐度在空腸中最高。這說明空腸、結(jié)腸和直腸的菌群對小熊貓的健康生長可能起著重要作用。
3 結(jié)論與討論
本研究采用 Q–PCR 技術(shù)檢測了 1 只臨床死亡小熊貓胃腸道 13 種菌群，其中，除白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌的豐度在直腸最高、腸桿菌科的豐度在空腸最高外，其他菌群的豐度均在小熊貓的結(jié)腸最高。白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌是反芻動物胃腸道(特別是瘤胃)主要的纖維降解菌，能將宿主難以直接消化的纖維物質(zhì)在初次到達(dá)消化道時就被逐一降解，并產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等營養(yǎng)物質(zhì)被宿主吸收和利用[23]。小熊貓雖然以箭竹等纖維類為主要食物，但其在動物食性分類上仍舊歸為肉食動物[24]，并且與其他哺乳動物相比，小熊貓是無盲腸的動物，食物在其消化道中滯留的時間較短[25]。小熊貓具有較長的小腸和較短的大腸等消化道結(jié)構(gòu)特征[4]，這使得其進(jìn)食的纖維類食物在消化道中被快速地通過，因而使其后腸段中也分布著較多的纖維降解菌。如本研究中的白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、梭菌類群 XIVa 和梭菌類群 IV 等在小熊貓的后腸段中被大量檢測出。本研究中大多數(shù)菌屬(乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬和腸球菌屬等)的豐度在小熊貓結(jié)腸最高，這可能與其結(jié)腸的消化功能密切相關(guān)。這個結(jié)果與本課題組前期對小熊貓胃腸道菌群的 DGGE 分析和高通量測序分析結(jié)果[10–11]一致，3 種檢測結(jié)果均表明小熊貓大腸菌群的豐度和多樣性較高。結(jié)腸是哺乳動物胃腸道中參與吸收、分泌和細(xì)菌消化的活躍部位，前腸中未被分解的植物多糖在該腸段被其中的厭氧菌分解，且微生物的數(shù)量及多樣性不易受外界物質(zhì)影響[26]。這可能也是本研究中檢測的差異不顯著菌群在小熊貓結(jié)腸的豐度仍然較高的原因。本研究未對其消化道代謝物質(zhì)進(jìn)行檢測，因此，今后的研究有必要結(jié)合胃腸道代謝物進(jìn)行分析。
2018 年，研究者運(yùn)用高通量測序技術(shù)對不同食性哺乳動物(食肉動物、雜食食肉動物、草食食肉動物和草食動物)糞便的菌群進(jìn)行了深入分析，與其他食性的動物相比，厚壁菌門、藍(lán)藻菌門 (Cyanobacteria)、藍(lán)藻菌科(Cyanobacteraceae)、腸桿菌科、梭菌科和腸球菌屬是小熊貓和大熊貓等的差異菌群[27]。同樣，本研究也檢測了幾種差異菌群，但小熊貓胃腸道的腸球菌屬和梭菌類群 XIVa 豐度差異不顯著，而腸桿菌科的豐度差異顯著。腸球菌屬和梭菌類群 XIVa 都是屬于厚壁菌門的菌群，在本課題組前期對小熊貓胃腸道菌群的研究中，也發(fā)現(xiàn)厚壁菌門是僅次于變形菌門的優(yōu)勢菌門，且其屬水平的優(yōu)勢菌為腸球菌屬和梭菌屬[10]。測序研究發(fā)現(xiàn)，梭菌類群 XIVa 是大熊貓糞便菌群中消化纖維素的主要菌群之一[28]。同樣，研究者對野生和圈養(yǎng)小熊貓糞便微生物進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn)，來自厚壁菌門的未鑒定 OTU001 是圈養(yǎng)小熊貓糞便優(yōu)勢菌，而來自變形菌門的假單胞菌科 OTU003 則是野生小熊貓糞便優(yōu)勢菌[8]。然而，本研究僅對來自變形菌門的腸桿菌科進(jìn)行了分析，結(jié)果表明該菌群是小熊貓胃腸道的差異菌群，且在空腸、結(jié)腸和糞便中的豐度較高。通常，腸桿菌科中大多數(shù)菌屬是條件致病菌，但近年來也發(fā)現(xiàn)腸桿菌科中一些菌屬對動物腸道的消化吸收是有益的。例如，來自腸桿菌科的埃希氏桿菌屬志賀氏桿菌在以竹子嫩枝為主食的大熊貓腸道中是優(yōu)勢菌群，可能參與了氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝過程[29]。同時，埃希氏桿菌屬志賀氏桿菌也是不同斷奶階段小熊貓糞便中的優(yōu)勢菌群[6]。本課題組前期對小熊貓胃腸道菌群的高通量測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，埃希氏桿菌屬是其胃腸道的優(yōu)勢菌屬[10]，但未對該菌屬具體的功能和作用進(jìn)行分析;因此，腸桿菌科(特別是埃希氏桿菌屬志賀氏桿菌)的培養(yǎng)、分離鑒定及代謝相關(guān)研究可作為今后小熊貓菌群研究的方向之一。
研究表明，梭菌屬、乳酸桿菌屬和擬桿菌屬在動物死亡后的第 6~9 天會分解利用尸體的有機(jī)物繼續(xù)繁殖生長[30]，而本研究的小熊貓胃腸道樣品采集自其死亡的當(dāng)天，故胃腸道微生物不會受其死亡的影響。另外，本研究僅對 1 只臨床死亡的小熊貓胃腸道微生物進(jìn)行了研究，動物數(shù)量和樣品有限，所以今后應(yīng)關(guān)注更多小熊貓胃腸道菌群及與其他野生動物菌群的比較分析。
綜上所述，小熊貓胃腸道不同腸段棲息著大量細(xì)菌且其豐度有差異，大多數(shù)菌群的豐度在結(jié)腸較高，而腸桿菌科菌群豐度在空腸最高且在各腸段差異顯著，今后可作為小熊貓胃腸道菌群研究的主要方向之一。
