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摘 要： 摘要：在高中階段的生物學習中，了解到21世紀是生物技術大發展時期，各種技術革新紛紛涌現，本人對這一專業產生了興趣，因此于2018年7月暑假期間來到寧波酶賽生物工程有限公司學習相關知識。該公司擅長生物酶和菌種相關的專業催化技術，在制藥工程、精細化工
摘要：在高中階段的生物學習中，了解到21世紀是生物技術大發展時期，各種技術革新紛紛涌現，本人對這一專業產生了興趣，因此于2018年7月暑假期間來到寧波酶賽生物工程有限公司學習相關知識。該公司擅長生物酶和菌種相關的專業催化技術，在制藥工程、精細化工、新型材料、生物產業、節能環保產業等領域提供技術支持。由于時間有限，在學習過程中，我著重了解并參與了構建定點突變單克隆的過程研究。
關鍵詞：生物學習;定點突變單克隆
一、研究背景
單克隆技術當下是國內外的熱點研究課題，但國內對于單克隆技術的研究仍存在一些問題，對單克隆領域的關鍵技術研究是遠遠不夠的，還有待進一步提高。單克隆與克隆技術是兩個不同的研究方向，區別在于克隆的定義更為廣泛，克隆原意以無性繁殖或營養繁殖的方式培育植物，隨后范圍擴展至以無性繁殖的方式培育動物：眾所周知的典型代表為1996年的多利羊。雖然克隆有巨大的理論意義和實用價值，但它是一把雙刃劍，有優點的同時也存在危險，它可能觸及人類倫理道德方面的底線，因此各國也出臺相關法律。而單克隆是指單一序列的質粒在平板上長出的菌落，只是利用克隆的理論和原理，培育的對象是不同的，單克隆主要針對質粒(如大腸桿菌等自身攜帶質粒)，安全性因此更高，同樣不會有悖于人類倫理道德。
因此，設計這個課題目的旨在了解構建定點突變單克隆的基本過程，對于并非定點的突變單克隆還并未嘗試。
二、理論及技術支持
以《分子生物學》和《細胞生物學》理論為基礎，生物信息學技術和PCR技術為指導進行實驗研究。
三、研究過程
(一)研究目的
在完成單克隆制備的流程時，先運用生物信息學技術和PCR技術，使用計算機設計含有定點突變位點的引物在模板載體上進行PCR擴增，再與標準DNAmarker表對比，判斷其是否是假陽性，最終完成檢測篩選過程。
(二)準備條件
1.實驗器材(具備條件)：
12頭移液槍(2～20μl)，PCR儀，恒溫水浴鍋，掌上離心機，渦旋儀，2ml離心管，離心管架，刀片，凝膠，計算機，平板，紫外凝膠顯色儀，marker表
2.準備工作
①帶實驗手套
�、谳d體的制備：選用合適的質粒，選擇同一種限制性核酸內切酶打開環狀結構，便于后續過程中與連接產物連接。
�、墼O計引物：引物最好選用DNA，因為RNA在外界容易降解，所以在體外用DNA易操作，引物長度一般在15個堿基左右，在引物中加標記基因，用計算機，輸入模板，設計多個突變位點。
�、芤锏南♂專簩⑵溲b入離心管中，用離心機將其稀釋。注意要先離心后再開蓋加水，因為DNA是干粉狀態，運輸過程中有可能粘附在管蓋和管壁上，直接打開后可能會丟失部分。加水量為DNA合成報告單上的nmol數目*100。
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(三)實驗步驟和過程
1.擴增帶突變的小片段(用PCR)，并用一種混合型酶消化模板基因。
2.將小片段拼成大片段。
3.目的片段擴增(PCR)：擴增獲得含有突變位點的基因。
4.酶切：切出粘性末端，便于后期和載體連接。使用的限制性核酸內切酶通常放置于冰箱中，因為其較脆弱，使用時才將其取出。限制性核酸內切酶具有特異性，切出目的基因和切開環狀載體時應該選擇同一種限制性核酸內切酶，使其產生相同的粘性末端以連接。
5.切膠回收：用刀片在紫外凝膠顯色儀中操作。提純酶切的基因。切完情況如圖，用切膠回收試劑盒提取待用。在紫外燈下切膠回收時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，防止出現外源DNA的污染。
6.連接：使用DNA連接酶，將載體通過特定的內切酶切出與產物相同的粘性末端。
7.轉化：轉化到大腸桿菌中，利用熱量，類似質壁分離原理，制造出一些微小的“孔”讓DNA進入。
8.涂平板：檢測篩選，原理如下：之前擴增DNA的時候就已經帶有了標記基因如xx抗性基因或者某顯色基因，放入xx基因的平板上，利用選擇培養基的原理進行培養，觀察其是否在平板上生長和顯色。
9.電泳檢測：用電泳儀。電壓一般采用5V/cm，可以有適當的電壓差。溫度在4~30℃都可行，常在室溫下進行。但電流過大時凝膠溫度升高，溶液蒸發，會造成電泳異常。將移液槍量程調至4μl，用其吸取DNA和染色劑，將其打入水平電泳槽中的凝膠的一排孔中(12個孔)，蓋上蓋子，用紫外凝膠顯色儀可以看見條帶，用DNAmarker對照看bp(堿基數)是否正確。凝膠電泳兼有分子篩和電泳雙重效果，所以分離效率很高。應用凝膠電泳可以正確的測定DNA片段的分子大小。
四、研究結論和反思
(一)結論
通過以上一系列實驗，本人正確構建定點單克隆突變，并保證突變出現的效率足夠高，確認該實驗可行性，通過參與實驗確認其具有足夠高的安全性和操作簡便性。單克隆操作流程嚴謹科學，卻有較高的簡便性，它有較高的使用價值和發展前景。
(二)反思
在一系列操作流程中，我也遇到了一些問題，通過對失敗經驗的總結，進行以下反思：
1.在使用12頭移液槍將DNA混合染色劑注入凝膠的一排孔中的過程中失敗過幾次，原因在于未用手扶正移液槍，導致移液槍尖端扎入凝膠中，無法將液體導入小孔中進行電泳操作。
2.實踐中存在構建多個突變位點過程中，偶爾有幾個沒出現突變現象，原因在于模板基因依舊存在。
3.在轉移液體時也出現過轉移錯離心管的問題，因此在操作過程中務必細心。
4.在進行引物的稀釋這一實驗準備步驟的過程中，第一次并未先進行離心操作后再開蓋加水，導致部分粘附在管蓋上的DNA干粉丟失。
5.涂平板時沒有在完全無菌的環境下進行，導致菌落污染。
