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摘 要： [摘要] 目的：構建表達螢光素酶報告基因的重組人 7型腺病毒(HAdV7)Ad7-dE1-dE3-Luc(Ad7-Luc)病毒，用于檢測人群中HAdV7的中和抗體水平。方法：利用同源重組方法構建E1區(qū)和E3區(qū)部分缺失，并在E1區(qū)嵌入螢光素酶基因表達框的pAd7-Luc重組質粒，轉染HEK-293細胞
[摘要] 目的：構建表達螢光素酶報告基因的重組人 7型腺病毒(HAdV7)Ad7-dE1-dE3-Luc(Ad7-Luc)病毒，用于檢測人群中HAdV7的中和抗體水平。方法：利用同源重組方法構建E1區(qū)和E3區(qū)部分缺失，并在E1區(qū)嵌入螢光素酶基因表達框的pAd7-Luc重組質粒，轉染HEK-293細胞，包裝出能夠表達螢火蟲螢光素酶的Ad7載體重組病毒(Ad7- Luc);選取HAdV7陽性血清樣本對新建立的報告基因檢測方法的準確性和穩(wěn)定性進行驗證;最后，利用該方法對北京地區(qū)60份血清樣本進行HAdV7中和抗體檢測。結果：獲得能夠表達螢火蟲螢光素酶的Ad7-Luc重組病毒，病毒滴度可達 4.85×108 IFU/mL，Ad7-Luc 檢測法與傳統細胞病變效應(CPE)法具有很好的一致性(R2 =0.8612，P<0.0001), 批內和批間差異分別在 10%和 20%以內。北京地區(qū) 60 例血清樣本的檢測結果顯示，HAdV7 血清陽性率約為 60% (36/60)，明顯低于 HAdV5 血清陽性率 75%(45/60)，75%的 HAdV7 陽性血清中和抗體滴度集中于低滴度水平(12~ 200)。結論：與傳統的細胞病變方法相比，HAdV7 中和抗體報告基因檢測方法更快速、靈敏、準確，適用于人群中 HAdV7血清流行病學調查及其疫苗的中和抗體研究。
[關鍵詞] 人7型腺病毒;螢光素酶報告基因;中和抗體;血清流行病學調查
人腺病毒(human adenovirus，HAdV)屬于腺病毒屬，是一種無包膜的雙鏈 DNA 病毒。已報道的 HAdV 有 90 種，根據血清學及分子學特性，分為 A~G 共 7 個亞群[1-2] 。腺病毒感染可引起多種臨床綜合征，包括呼吸道疾病、結膜炎、膀胱炎、腸胃炎、神經系統疾病等，某些情況下甚至能夠導致死亡[3] 。據報道，HAdV 是世界范圍內急性呼吸道疾病的主要原因之一，5%~10%的兒童下呼吸道感染是由其導致的[4] 。B 亞群的 3、7、14、21、55 型和 C 亞群的 1、2、5、6 型 HAdV 是全球范圍內引起急性呼吸系統疾病的主要病原體[5] 。據世界衛(wèi)生組織報告，7 型 HAdV(HAdV7)占所有 HAdV 感染的近 20%，并且引起的疾病也最為嚴重，特別是對于小于 7 歲的兒童和免疫缺陷人群[4,6-7] 。
HAdV7 也是造成我國腺病毒感染的主要血清型，近年來在我國北京、湖北、廣州、陜西、湖南等地和軍營都有較大規(guī)模的 HAdV7 疫情暴發(fā)，造成了嚴重損失[8-13] 。現階段沒有治療 HAdV7 感染的有效藥物，美國國防部和梯瓦制藥聯合研發(fā)的 4 型和 7 型口服腺病毒活疫苗在預防腺病毒疫情暴發(fā)方面顯示出很好的效果[14] 。迄今，我國沒有相關疫苗上市。目前檢測血清中腺病毒中和抗體的方法有兩類：一種是細胞病變法，腺病毒與抗體孵育后，觀察感染細胞產生的細胞病變效應(CPE)或者檢測細胞的活性;另一種則是報告基因法，血清中的中和抗體能夠抑制病毒感染從而降低報告基因的表達水平，通過檢測報告基因表達被抑制程度來確定中和抗體水平，常用的報告基因有 LacZ、GFP 和螢光素酶基因。傳統的 CPE 法周期長(4~8 d)，觀察比較主觀，靈敏性低，不適于快速準確檢測[15] ;而報告基因法可將檢測時間縮短至 30 h，方法的重復性好[16] 。本實驗中，我們構建了表達螢光素酶的復制缺陷型 Ad7-Luc 重組病毒，建立了基于該重組病毒的 HAdV7 中和抗體檢測方法，檢測了北京地區(qū) 60 例血清中和抗體水平，初步了解 HAdV7 的預存免疫水平。
1 材料與方法
1.1 材料
收集 2017 年 3 月于解放軍總醫(yī)院體檢人群的血清樣本，血清分裝后于-20℃凍存，共 60 份，其中男性和女性各 30 份。另外，選取經 CPE 法驗證的 36 份 HAdV7 陽性血清樣本用于報告基因法的建立和驗證。
HEK-293 細胞、A549 細胞由本實驗室保存，兩者分別用含 10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和 100 U/mL 青霉素的 DMEM 和 1640 培養(yǎng)液，于 37℃、5% CO2 飽 和 濕 度 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng) ;HAdV7- GZ08(GenBank No.GQ478341)毒株由本室保存;大腸桿菌 Trans1-T1 感受態(tài)細胞購自全式金生物有限公司;大腸桿菌 BJ5183 感受態(tài)細胞由本室自備;胎牛血清、DMEM 和 1640 培養(yǎng)液、青/鏈霉素、 Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit、 Tubfect 轉染試劑、質粒大提試劑盒均購自賽默飛世 爾 科 技(中 國)有 限 公 司 ;Gibson Assembly Cloning Kit，限制性內切酶 FspⅠ、AsiSⅠ、EcoRⅠ- HF、AatⅡ 、BsiWⅠ 和 T4 DNA 連 接 酶 體 系 購 自 NEB 公 司 ;2 × EX Taq Mix、Pyrobest PCR 體 系 、 DNA marker、凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒和 DNA 片段回收試劑盒均購自 TaKaRa 公司;螢火蟲螢光素酶分析試劑和細胞裂解試劑購自 Pro⁃ mega 公 司 ;XenoLight D- Luciferin Potassium salt 購自 Perkin Eimer 公司;引物合成和測序交由上海生物工程有限公司完成。
1.2 Ad7-Luc 重組病毒的制備
首 先 用 Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit 從腺病毒培養(yǎng)液中提取 HAdV7-GZ08 的基因組，以其為模板擴增帶有 HAdV7 基因組的左右同源臂片段;以 pAd4-dE3-luc 質粒(實驗室前期制備)為模板，利用重疊 PCR 法構建含卡那霉素抗性基因及 pBR322 復制原點的載體區(qū);然后將上述片段用 Gibson Assembly Cloning Kit 的方法體外重組，從而獲得同源重組質粒 pAd7-re;接下 來 用 FspⅠ 內 切 酶 線 性 化 的 pAd7- re 片 段 與 HAdV7-GZ08 的基因組通過電轉化在 BJ5183 感受態(tài)細胞中進行同源重組，從而獲得 HAdV7 的空載質粒 pAd7-V0;后續(xù)用 EcoRⅠ-HF 內切酶對質粒 E3 區(qū) 進 行 部 分 缺 失 和 再 連 接 獲 得 pAd7-dE3 質粒;最后用 AatⅡ和 BsiWⅠ內切酶對 E1A 區(qū)進行缺失并插入帶有 MCMV 啟動子的螢光素酶報告基因表達框，最終獲得重組 pAd7-Luc 質粒。相關引物序列見表 1。
用 AsiSⅠ內切酶將 pAd7-Luc 質粒線性化，并用 Tubfect 轉染試劑將其導入 HEK-293 細胞，培養(yǎng) 3~7 d 直至細胞完全病變，并通過連續(xù)傳代觀察其穩(wěn)定性，最終獲得成熟的病毒顆粒，采用蛋白免疫法檢測腺病毒滴度。
1.3 Ad7-Luc 重組病毒的體外和體內實驗驗證為了驗證
Ad7-Luc 重組病毒是否構建成功，首先提取相關重組質粒和病毒基因組進行 PCR 擴增，并將擴增產物測序;其次采用蛋白免疫法檢測獲得的病毒滴度，用不同感染復數(MOI)的病毒感染 A549 細胞，檢測 24 h 后螢光素酶的表達 情 況 ;最 后 ，將 經 過 Source 30Q 純 化 的 重 組 pAd7-Luc 病毒以 1×107 IFU/只的劑量通過肌肉注射途徑感染 BALB/c 小鼠，24 h 后用小動物活體成像儀觀察螢光素酶的表達情況。
1.4 報告基因法檢測抗 HAdV7 中和抗體的建立與驗證
針對 HAdV7 中和抗體的檢測參照 5 型腺病毒螢光素酶報告基因檢測方法[16] 。將血清于 56℃滅活處理 1 h，并將其按照首孔 1/4 稀釋、后續(xù)逐步 1/3 稀 釋 ，最 終 得 到 1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶ 324、1∶972、1∶2916 共 7 個 稀 釋 度 的 血 清 ;將 50 μL 稀釋后的血清轉移至新的 96 孔細胞培養(yǎng)板中，每個樣本設置 2 個復孔，并設置不加血清和病毒的陰性孔，以及加入 50 μL 病毒的陽性孔;每孔加入 50 μL 稀釋的 Ad7-Luc 重組病毒液，病毒最終含量為 2×104 IFU/孔，混勻后 37℃孵育 1 h;將 A549 細胞用含 2%胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液稀釋 至 2 × 105 /mL，每 孔 加 入 100 μL，于 37℃ 、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h;最后將細胞裂解，用螢光素酶分析檢測試劑盒檢測其表達水平。
中和抗體滴度以陽性對照的螢光素酶表達為參照，將在血清稀釋度中病毒螢光素酶表達抑制達到 90%(IC90)時認定為該血清的中和抗體值，用 GraphPad Prism 軟件中的四參數非線性回歸進行計算。
為了進一步驗證報告基因法的可靠性，采用傳統的 CPE 法進行對比分析，觀察 2 種方法的一致性。將滴度為 2000 TCID50/mL 的野生型 7 型腺病毒與不同稀釋度的陽性血清樣本相互作用 1 h，用含 2%胎牛血清的 1640 培養(yǎng)基將細胞稀釋至 2.5×105 /mL，每孔加入 100 μL，培養(yǎng)至陽性對照孔完全病變后，每孔加入 20 μL MTS 溶液，37℃孵育 2 h，讀取 D490nm 值;最后，將 CPE 法獲得的中和抗體滴度與報告基因法進行一致性分析。此外，還對不同血清含量的培養(yǎng)基濃度，以及批間、批內檢測結果的一致性進行驗證分析。
1.5 統計學處理
采用 SPSS 19.0 軟件進行數據分析。采用單因素方差分析比較不同條件下測量的中和抗體滴度，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Ad7-Luc 重組病毒的制備與驗證
已建立的檢測 5 型腺病毒中和抗體的螢光素酶報告基因法廣泛應用于流行病學調查和相關 5 型腺病毒載體疫苗的評價工作[17- 18] 。基于此方法，本研究中我們通過同源重組，在 HAdV7 基因組 中 缺 失 E1A 區(qū) 并 插 入 螢 光 素 酶 基 因 而 獲 得 pAd7-Luc 質粒，具體流程如圖 1。所有片段在構建過程中都進行了測序分析(相關引物序列見表 1)，最終將構建的質粒經過包裝獲得成熟的復制缺 陷 型 Ad7- Luc 重 組 病 毒 顆 粒 ，病 毒 滴 度 可 達 4.85×108 IFU/mL。
提取 pAd7-V0 和 pAd7-Luc 質粒，以及 HAdV7 和 Ad7-Luc 重組病毒基因組，進行 PCR 擴增，測序結果證明螢光素酶片段的大小、序列及插入位點與預期一致(圖 2A)。以不同 MOI 的 Ad7-Luc 重組 病 毒 感 染 A549 細 胞 ，檢 測 到 的 熒 光 值 不 同 ， MOI 越高則熒光值越高(圖 2B);以 MOI=1 感染， 24 h 后 其 熒 光 值 約 為 8×105 。 為 了 進 一 步 驗 證 Ad7-Luc 重組病毒是否構建成功，將純化的 Ad7- Luc 重組病毒以 1×107 IFU/只的劑量通過肌肉注射途徑感染 BLB/c 小鼠，24 h 后通過小動物活體成像儀觀察熒光表達情況，Ad7-Luc 重組病毒注射部位可以檢測到明顯的熒光，對照組未檢測到熒光，單位時間和體積內熒光表達強度統計結果具有顯著性差異(Mann-Whitney 檢驗，P=0.0079)(圖 2C)。
2.2 基于 Ad7-Luc 重組病毒中和抗體檢測方法的建立與驗證
檢測不同數量的 A549 細胞感染不同稀釋度病 毒 24 h 后 的 熒 光 值 ，結 果 如 圖 3A，MOI 為 0.0625~1 時，熒光值與 MOI 具有較好的線性關系; MOI<0.016 時，平行孔間熒光值偏差較大。選擇 MOI 為 0.016~1 進行后續(xù)中和抗體檢測方法學研究。以 MOI=0.25、0.50、0.75 和 1.00 的病毒劑量，檢測 10 份 HAdV7 陽性血清的中和抗體值，結果如圖 3B，中和抗體檢測結果穩(wěn)定，4 組間抗體值無統計學差異(One-Way ANOVA 檢驗，n=10，P> 0.05)。參考 HAdV5 中和抗體檢測病毒滴度，實驗最終選擇 MOI=0.75 用于中和抗體檢測。采用傳統 CPE 法檢測中和抗體滴度，2 種方法的統計分析顯示了很好的一致性(R=0.8612，P<0.0001)(圖 3C)。此外，為了進一步驗證結果的可靠性，我們還對細胞培養(yǎng)基血清含量的影響進行考察，發(fā)現組間沒有明顯差異(圖 3D)。為了進一步驗證報告基因法檢測 HAdv7 中和抗體的穩(wěn)定性，我們選擇陽性血清樣本對批間和批內差異進行分析，結果顯示該方法可將批間差異控制在 20%以內，批間差異控制在 10%以內(圖 3E、F)，說明方法穩(wěn)定，重復性好。
2.3 北京地區(qū)人群 7 型腺病毒中和抗體陽性率
基于建立的報告基因檢測方法，我們于 2017 年 3 月收集了北京地區(qū)共計 60 份血清樣本，男女各占 50%，分別進行了針對 7 型腺病毒和 5 型腺病毒中和抗體水平的檢測，將中和抗體滴度按照 <12、12~200、201~1000 和>1000 依次定義為陰性、低滴度、中滴度和高滴度。結果顯示北京地區(qū)針對 7 型腺病毒的血清陽性率為 60%(36/60)，明顯低于對應針對 5 型腺病毒的血清陽性率 75%(45/ 60)，并且該人群 7 型腺病毒的中和抗體水平多集中 在 12~200(低 滴 度)范 圍 內 ，占 總 人 群 的 45% (圖 4A、B)。圖 4C 所示該人群中 7 型腺病毒中和抗體滴度明顯低于 Ad5(Mann-Whitney 檢驗，P=0.0026);此外進一步對人群中男女性別間中和抗體水平進行統計分析，結果顯示 7 型腺病毒的中和抗體水平并不存在性別間的差異(Mann-Whit⁃ ney 檢驗，P=0.5828)(圖 4D)。
3 討論
自 1953 年 HAdV 首次被發(fā)現分離以來，陸續(xù)鑒定和分離的 HAdV 已有 79 種。4 型和 7 型腺病毒引起的急性呼吸系統疾病一直是美軍幾十年來重點監(jiān)測的類型，近年來在美國、中國、意大利、印度、韓國等國家腺病毒引起的呼吸系統疾病檢出率和病例呈上漲趨勢[2-3,14] 。HAdV7 作為造成我國腺病毒感染的主要血清型，近年來在我國多地和軍營都有較大規(guī)模的暴發(fā)[8-13] 。
國內針對 7 型腺病毒中和抗體的流行病學調查統計報道最早可追溯到 20 世紀 90 年代，趙錦銘等于 1995 年調查北京、南京、成都和海口的人群腺病毒中和抗體情況，結果顯示 HAdV7 總的血清陽性率約 22.2%，北京最高(33.5%)，海口最低(5.1%);1999 年成都地區(qū)人群腺病毒中和抗體調查結果顯示 HAdV7 血清陽性率約為 15.4%[19- 20] 。然而自 2000 年以來，國內并未有新的有關 7 型腺病毒中和抗體的調查報告，一個重要的原因就是檢測方法的限制。傳統檢測方法主要依據其引起的細胞病變去判斷，具有主觀性，同時還存在周期長(4~8 d)、穩(wěn)定性差、靈敏度低等不足之處。而報告基因法中，螢光素酶活性檢測比 LacZ 和 GFP 等報告基因檢測更敏感，操作方法也更為簡便快捷，并且所需靶細胞更少，使其適于大規(guī)模樣品的流行病學調查研究[15-16,21] 。
我們基于 5 型腺病毒中和抗體螢光素酶報告基因法，通過同源重組方法構建復制缺陷型表達螢光素酶報告基因的 Ad7-Luc 重組病毒，并對病毒量、細胞數量及培養(yǎng)基血清濃度等因素逐一驗證，獲得了最佳的中和抗體檢測方法。在實驗過程中將該方法與傳統的 CPE 檢測方法進行比較，二者顯示了良好的一致性，并且該報告基因檢測方法批間批內實驗展現了很好的穩(wěn)定性和準確度。此方法的建立將檢測周期縮短至 1 d，更加適用于大規(guī)模血清樣本的 HAdV7 快速檢測，對了解和研究我國 HAdV7 的血清流行病學提供了非常重要的方法。
基于該螢光素酶報告基因法，我們收集并完成了北京地區(qū) 60 份血清樣本的 HAdV7 和 HAdV5 中和抗體檢測，發(fā)現 HAdV7 血清陽性率為 60%，中和抗體滴度多集中在 12~200(低滴度)水平。對比 1995 年和 1999 年相關報道，我們發(fā)現近 20 年來北京地區(qū) 7 型腺病毒血清陽性率由 33.5%上升到 60%，呈大幅度增長趨勢，由此可見 7 型腺病毒引起的感染逐漸增加，須引起足夠的重視[22] 。此外，本研究中 60 份血清樣本針對 HAdV5 中和抗體陽性率為 75%，抗體滴度大于 200 的樣本數占 總 體 的 45% ，與 前 期 報 道(中 和 抗 體 陽 性 率 72% ，抗 體 滴 度 大 于 200 的 樣 本 數 占 總 體 的 46.4%)一致[17] 。
研究發(fā)現 HAdV7 血清陽性率明顯低于 C 亞群的 HAdV5(72%)，顯著高于同亞群的 HAdV14 (24.8%)和 HAdV55(22.4%)，其 中 HAdV14 和 HAdV55 中和抗體滴度分別集中在 201~1000(中滴度)和 1>1000(高滴度)水平[3] ，這一研究結果也進一步證實 HAdV7 是 B 亞群中更加易感的潛在血清型，其流行病學調查研究具有非常重要的意義。同時，不同性別間中和抗體水平分析表明在不同性別間 HAdV7 的感染沒有明顯差異，該結論與 HAdV14 和 HAdV55 相一致。此外，不同年齡段人群中 HAdV7 中和抗體預存免疫水平仍須擴大樣本含量做進一步的統計分析。
期刊推薦：《基因組學與應用生物學》Genomics and Applied Biology(雙月刊)曾用刊名：廣西農業(yè)生物科學;廣西農業(yè)大學學報&廣西大學學報(農業(yè)與生物科學版);廣西農學院學報，1982年創(chuàng)刊，為基因組時代的理論與應用生物學提供服務的科學雜志,將面向基因組學、分子遺傳學、生化與分子生物學等基礎學科領域，著重刊登農林科學、醫(yī)藥科學、動物科學、環(huán)境、生態(tài)領域的研究成果。
HAdV7 作為一種潛在的易感腺病毒血清型，其引起的危害須得到進一步關注和重視，基于螢光素酶報告基因中和抗體檢測方法的建立，對于了解和掌握我國 HAdV7 預存免疫水平以及相關腺病毒疫苗的研發(fā)評價等工作具有重要意義。
