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摘 要： 摘要:為了研究知母須根總黃酮(TF)最佳超聲提取工藝及其解熱作用。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法研究乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等四個(gè)因素對(duì)總黃酮提取量的影響，根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型確定最佳提取工藝。以干酵母致熱大鼠為動(dòng)物模型，通過測(cè)定大
摘要:為了研究知母須根總黃酮(TF)最佳超聲提取工藝及其解熱作用。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法研究乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等四個(gè)因素對(duì)總黃酮提取量的影響，根據(jù)擬合的數(shù)學(xué)模型確定最佳提取工藝。以干酵母致熱大鼠為動(dòng)物模型，通過測(cè)定大鼠血清中TNF-α、PGE-2、IL-6、AVP的含量研究其解熱作用。知母須根總黃酮最佳提取工藝為:乙醇濃度為70%，提取時(shí)間40min，液料比為50mL/g，提取次數(shù)2次。解熱實(shí)驗(yàn)表明知母須根總黃酮提取物可顯著降低發(fā)熱大鼠模型體溫及血清、下丘腦中TNF-α、PGE-2、IL-6的含量，升高發(fā)熱大鼠模型血清及下丘腦中AVP的含量。本研究表明知母須根總黃酮具有一定的解熱作用，本文可為知母須根開發(fā)利用提供參考依據(jù)。
關(guān)鍵詞:知母須根;總黃酮;提取工藝;解熱作用
知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloideBunge.)的干燥根莖，具有清熱解毒、瀉火滋陰等功效[1]。其須根是知母產(chǎn)地加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，總量占根莖采收總量的30%左右，知母須根的廢棄不用造成了一定程度的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。課題組前期研究表明知母須根中主要含有黃酮類、甾體皂苷、多糖等化學(xué)成分[2，3]。
天然植物中的黃酮類成分大多具有較好的解熱、抗炎的藥理活性[4，5]，且有文獻(xiàn)研究表明知母須根和主根具有相近的化學(xué)成分組成[6]。為更好的利用知母須根這一資源，本研究以知母須根為研究對(duì)象，以響應(yīng)面法優(yōu)選知母須根總黃酮提取工藝，以干酵母致熱大鼠模型研究其解熱作用，以探討其解熱的作用機(jī)制，為知母須根深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1儀器與試劑
紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司，中國，UV1600)，酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司，美國)。腫瘤壞死因子-α、白介素-6、前列腺素E-2、精氨酸升壓素等試劑盒均購于上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，芒果苷對(duì)照品(成都領(lǐng)航者生物科技有限公司，中國，批號(hào):4773-96-0)。阿司匹林腸溶片(南京白敬宇制藥有限公司，中國，批號(hào):國藥準(zhǔn)字H32026500)。
安琪高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司，中國，批號(hào):GB/T20886)。
1.2藥材與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
1.2.1藥材
知母須根2017年11月份收集于安徽廣印堂中藥飲片股份有限公司知母種植基地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)金傳山教授鑒定為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloideBunge.)的須根。
1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)SD大鼠(周齡8周，雌雄各半，180～220g)購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):scxk(皖)2017-001)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。
1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
精密稱定一定量的芒果苷對(duì)照品，溶解并稀釋，分別制成0.83、1.00、1.16、1.33、1.49μg/mL的對(duì)照品溶液，加入1mL5%NaNO2，搖勻，靜置6min，加入1mL10%Al(NO3)[7]3，搖勻，靜置6min，加入10mL4%NaOH，搖勻，靜置15min，用70%乙醇定容至25mL，于258nm下測(cè)定吸光度，以吸光度和芒果苷質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4知母須根總黃酮提取工藝及提取量的測(cè)定
精密稱定知母須根粉末1g于具塞錐形瓶中，加入適量溶劑進(jìn)行超聲提取，分別考察不同的乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響，根據(jù)1.3項(xiàng)下的線性方程測(cè)定總黃酮含量并計(jì)算總黃酮的提取量。總黃酮提取量(mg/g)=提取液中總黃酮含量/藥材重×100%。
1.4.1單因素實(shí)驗(yàn)
1.4.1.1乙醇濃度對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響
固定超聲時(shí)間為30min，料液比為1∶40，提取次數(shù)為1次，考察乙醇濃度分別為10%、30%、50%、70%、90%等五個(gè)水平對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響，每個(gè)因素平行實(shí)驗(yàn)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。
1.4.1.2提取時(shí)間對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響
固定乙醇濃度為70%，料液比為1∶40，提取次數(shù)為1次，考察超聲提取時(shí)間為20、30、40、50、60min等五個(gè)水平對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響，每個(gè)因素平行實(shí)驗(yàn)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。
1.4.1.3料液比對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響
固定乙醇濃度為70%，提取次數(shù)為1次，超聲提取時(shí)間為40min，考察料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70等七個(gè)水平對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響，每個(gè)因素平行實(shí)驗(yàn)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。
1.4.1.4提取次數(shù)對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響
固定乙醇濃度為70%，超聲提取時(shí)間為40min，料液比為1∶50，分別考察提取次數(shù)為1、2、3、4、5等對(duì)知母須根總黃酮提取量的影響，每個(gè)因素平行實(shí)驗(yàn)5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。
1.4.2響應(yīng)面法優(yōu)選知母須根總黃酮提取工藝
在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取1.4.1項(xiàng)下影響總黃酮提取量的四個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總黃酮提取量為指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取條件，因素水平見表1。
1.5總黃酮提取物的解熱作用研究
1.5.1發(fā)熱動(dòng)物模型建立、動(dòng)物分組及給藥
1.5.1.1干酵母混懸液配制
取干酵母15g于研缽中，緩慢加入蒸餾水90mL并研磨至均勻的混懸液，將混懸液倒入燒杯中，然后取10mL蒸餾水洗滌研缽內(nèi)壁，最終制備成15%的干酵母混懸液。
1.5.1.2發(fā)熱動(dòng)物模型建立發(fā)熱模型建立
:將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，外部保持環(huán)境不變，每日用電子體溫計(jì)測(cè)量肛溫2～3次，使其適應(yīng)電子體溫計(jì)，取體溫于37.0～38.0℃且體溫變化小于0.3℃的大鼠供實(shí)驗(yàn)造模用。隨機(jī)取大鼠若干，每只進(jìn)行背部皮下注射15%的干酵母混懸液(10mL/kg)，每隔1h測(cè)定一次肛溫，以基礎(chǔ)體溫上升1℃(5h后)以上的為發(fā)熱鼠，視為造模成功。
1.5.1.3動(dòng)物分組及給藥
將已測(cè)定肛溫的實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分5組(正常組、模型組、阿司匹林(陽性藥)組、知母須根總黃酮提取物組)，每組10只。前期研究表明，知母須根總黃酮提取物在劑量為4g/kg時(shí)即可發(fā)揮解熱作用。實(shí)驗(yàn)用陽性藥為阿司匹林，給藥劑量為0.1g/kg，給藥方式為灌胃給藥。
給藥組先用知母須根總黃酮提取物組連續(xù)灌胃給藥三天，第四天造模，造模后再灌胃知母須根總黃酮提取物一次，分別于造模前、造模后、末次給藥0.5、1、2、3、4、5h測(cè)量各組大鼠肛溫。
1.5.2大鼠血清及下丘腦中細(xì)胞因子的測(cè)定
待大鼠體溫測(cè)定后，腹腔注射15%的水合氯醛溶液1mL/100g麻醉大鼠，分別進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血及分離大鼠下丘腦。全血以3000rpm離心15min，取上清液;下丘腦樣本稱定重量后用生理鹽水研磨成10%的下丘腦勻漿;按照試劑盒的要求測(cè)定血清及下丘腦中TNF-α，IL-6，AVP，PGE-2水平。
2結(jié)果與分
2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，芒果苷在0.83～1.49μg/mL之間質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.3867x+0.0772(r=0.9995)。結(jié)果見圖1。
2.2各因素對(duì)總黃酮提取量的影響
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)可知，不同乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)知母須根總黃酮提取量均有影響。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以70%乙醇作為最佳提取溶劑，最佳料液比為1∶50，最佳提取時(shí)間為40min，最佳提取次數(shù)為2次。
2.3響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析
根據(jù)“2.2”項(xiàng)下單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的最佳因素水平，選取乙醇濃度，提取時(shí)間，料液比，提取次數(shù)等四個(gè)因素，采用Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)共29組，每組實(shí)驗(yàn)共平行三份，探討各因素水平對(duì)超聲提取知母須根總黃酮提取量的影響，結(jié)果見表2。本設(shè)計(jì)方案中A、B、C、D為三維空間的頂點(diǎn)，構(gòu)成析因點(diǎn)，析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)共12組;區(qū)域中心點(diǎn)為零點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)編號(hào)為3、11、13、17、19共5組，作為中心設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，可對(duì)實(shí)驗(yàn)誤差進(jìn)行估算。最終擬合的總黃酮提取量(Y)的二次多項(xiàng)式方程為:
Y=53.62-3.98A-0.022B+0.18C+5.39D-0.73AB-0.46AC+6.71AD-0.090BC-1.22BD-0.075CD-16.89A2-3.48B2-3.12C2-4.92D2
本模型的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)等項(xiàng)方差分析結(jié)果及模型的決定系數(shù)能夠反映該分析模型是否可靠，結(jié)果見表3。該模型的P<0.05，有一定的著性，另外該模型的校正決定性系數(shù)RAdj2=0.5049，說明該模型對(duì)知母須根總黃酮成分超聲提取實(shí)驗(yàn)的擬合程度好，可靠性較高，能夠?qū)?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋分析。由A、B、C、D各因素的F值可知，影響知母須根總黃酮提取量的因素從高至低依次是提取次數(shù)(D)、乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、液料比(C)。
由響應(yīng)面圖與等高線圖結(jié)果顯示，固定液料比與提取次數(shù)，總黃酮提取量隨著乙醇濃度和提取時(shí)間的同時(shí)增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，由等高線圖可看出，乙醇濃度所呈現(xiàn)的等高線分布較為密集，說明乙醇濃度在總黃酮提取量上較提取時(shí)間的影響大，由等高線橢圓的規(guī)則程度可以判斷，乙醇濃度和提取時(shí)間有較為顯著的交互作用，另外當(dāng)乙醇濃度不變時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加總黃酮提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能原因?yàn)椴糠贮S酮類成分在超聲過程中結(jié)構(gòu)受到了破壞或發(fā)生了轉(zhuǎn)變，故提取時(shí)間不宜過長(zhǎng)。由此可得即當(dāng)乙醇濃度為58%～77%時(shí)，提取時(shí)間為40min時(shí)，知母須根總黃酮響應(yīng)值最高。固定提取時(shí)間與提取次數(shù)，隨著乙醇濃度和液料比的同時(shí)增加總黃酮提取量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，根據(jù)分析，當(dāng)乙醇濃度為58%～77%時(shí)，液料比為45～55mL/g時(shí)，知母須根總黃酮響應(yīng)值最高。分析比較并模擬出最佳提取工藝:乙醇濃度為70%，提取時(shí)間40min，液料比為50mL/g，提取次數(shù)2次。在此條件下，知母須根總黃酮成分含量的預(yù)測(cè)值為53.62mg/g。
2.4驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
根據(jù)所擬合的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，共平行3次，所得知母須根總黃酮含量為53.79mg/g，與模型預(yù)測(cè)值53.62mg/g接近，表明該模型重現(xiàn)性良好。
2.5大鼠體溫測(cè)定結(jié)果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表4)顯示造模后5h內(nèi)，與正常組相比，模型組大鼠體溫顯著升高(P<0.01)，表明造模成功。知母須根總黃酮提取物在末次給藥5h后與模型組相比體溫顯著下降(P<0.05)，表明知母須根總黃酮提取物有一定的解熱作用。
2.5血清中相關(guān)細(xì)胞因子的測(cè)定
血清中相關(guān)因子測(cè)定結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、PGE-2、IL-6、AVP含量顯著升高。與模型組相比，知母須根總黃酮提取物可降低血清中TNF-α、PGE-2(P<0.05)及IL-6(P<0.001)的含量，升高血清AVP(P<0.05)的含量。
2.6大鼠下丘腦中相關(guān)細(xì)胞因子的測(cè)定
下丘腦中相關(guān)因子測(cè)定結(jié)果顯示，與模型組相比，知母須根總黃酮提取物可降低大鼠下丘腦中TNF-α(P<0.05)、IL-6、PGE-2(P<0.01)的含量，升高下丘腦中AVP(P<0.05)的含量。結(jié)果見表6。
3結(jié)論
本文采用了Box-Behnken方法優(yōu)選出知母須根總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度70%，提取時(shí)間40min，液料比50mL/g，提取次數(shù)2次。解熱實(shí)驗(yàn)研究表明，知母須根總黃酮提取物具有一定的解熱作用，其解熱機(jī)制可能是通過降低發(fā)熱大鼠模型血清中TNF-α、PGE-2、IL-6的含量、升高發(fā)熱大鼠模型血清中AVP的含量而發(fā)揮作用的。
芒果苷是知母須根中成分含量較高的一種黃酮苷類成分，且知母須根中各主要黃酮苷類成分在258nm下均有較強(qiáng)紫外吸收[8]，因此選擇芒果苷為對(duì)照品具有合理性。超聲提取法具有操作簡(jiǎn)便，提取時(shí)間短，提取效率高等優(yōu)勢(shì)，因此本文優(yōu)選出的最佳工藝具有較強(qiáng)的可操作性。
期刊推薦：《中國醫(yī)院藥學(xué)雜志》1981年創(chuàng)刊，是中國藥學(xué)會(huì)主辦、中國科協(xié)主管的國內(nèi)外公開發(fā)行的醫(yī)院藥學(xué)專業(yè)性學(xué)術(shù)期刊，為中國精品科技期刊。主要介紹國內(nèi)外醫(yī)院藥學(xué)創(chuàng)新性成果、藥學(xué)先進(jìn)技術(shù)、臨床合理用藥、中西藥制劑、醫(yī)院調(diào)劑、醫(yī)院藥學(xué)學(xué)科的科學(xué)管理與改革、藥學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)及理論等。
TNF-α是一種內(nèi)源性致熱原，是發(fā)熱疾病過程中的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，模型組的大鼠血清TNF-α顯著升高，因此導(dǎo)致大鼠發(fā)熱[9，10]，PGE-2是體溫調(diào)節(jié)最主要的物質(zhì)，尤其是在感染性發(fā)熱中其含量會(huì)顯著升高，PGE-2與受體結(jié)合后影響體溫調(diào)節(jié)點(diǎn)水平，從而引起機(jī)體體溫的變化[11]，IL-6是各種發(fā)熱的中間物質(zhì)，其生物學(xué)效應(yīng)呈現(xiàn)多樣性，在發(fā)熱機(jī)制中具有舉足輕重的作用[12]。AVP是內(nèi)源性的解熱物質(zhì)，在機(jī)體發(fā)熱時(shí)機(jī)體會(huì)通過分泌AVP來保護(hù)機(jī)體[13]。本文研究結(jié)果表明知母須根總黃酮提取物可以顯著降低發(fā)熱大鼠血清及下丘腦中TNF-α、PGE-2、IL-6的含量，升高AVP的含量，表明知母須根總黃酮提取物具有一定的解熱作用。
知母須根是知母生長(zhǎng)發(fā)育過程中的非藥用部位，其與知母主根從同一組織生長(zhǎng)分化而來。知母藥性寒涼、具有清熱解毒之功，本文研究結(jié)果表明，知母須根總黃酮提取物也同樣具有一定的解熱作用，可為知母須根的綜合開發(fā)利用提供一定的依據(jù)。然而天然藥物中化學(xué)成分較多，其發(fā)揮藥效作用的機(jī)制復(fù)雜，知母須根總黃酮的解熱作用和化學(xué)成分尚需進(jìn)一步研究。
