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摘 要： 血管生成素?2(Angiopoietin?2，Ang?2)作為血管生成素家族(Angiopoietins,Angs)重要成員之一，在腫瘤血管生成中發揮調節作用。我們采用免疫組織化學方法對食管鱗癌組織標本中的Ang?2進行檢測,旨在探討其與食管鱗癌病理分級及浸潤、轉移之間的關系。
【關鍵詞】 血管生成素?2 食管腫瘤 血管形成 免疫組織化學
【Abstract】 Objective To investigate the expression of angiopoietin?2 (Ang?2) in human squamous carcinoma of esophagus and determine it‘s relationship with pathological grades, infiltration and metastasis factors. Methods S?P immunochemical method was performed to detect the expression of Ang?2 in esophagus tissues from 54 cases with squamous carcinoma of esophagus and 22 normal persons. The pathological grades, infiltration and metastasis factors were statistically analyzed. Results Of 54 cases with squamous carcinoma of esophagus, 37 cases had positive expression of Ang?2, with positive rate of 67.06%, which was significantly higher than that in normal esophagus (P<0.05). The expression rate of Ang?2 increased significantly with the increase of pathological grading and lymphatic metastasis (P<0.05). Conclusions The expression of Ang?2 may be positively related to clinical stages and pathological grades in squamous carcinoma of esophagus, indicating that Ang?2 may be involved in the neovascularization of carcinoma and in the occurrence and progression of squamous carcinoma of esophagus and hence can be a useful biological predictor of progression in esophageal carcinoma.
【Key words】 Angiopoietin?2; Squamous carcinoma of esophagus; Angiogenesis; Immunohistochemistry
血管生成素?2(Angiopoietin?2，Ang?2)作為血管生成素家族(Angiopoietins,Angs)重要成員之一，在腫瘤血管生成中發揮調節作用。我們采用免疫組織化學方法對食管鱗癌組織標本中的Ang?2進行檢測,旨在探討其與食管鱗癌病理分級及浸潤、轉移之間的關系。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
收集我院2005年10月至2006年3月行電子胃鏡檢查發現的原發性食管鱗狀細胞癌患者85例，其中男63例，女22例;年齡41～76歲，平均59.0歲。病理分級采用常用3級分級法[1]，其中Ⅰ級50例、 Ⅱ級27例、Ⅲ級8例。另選22例正常食管組織標本作對照。所有標本經10%甲醛溶液固定后常規石蠟包埋，制備成5 μm厚的連續切片，用于免疫組織化學染色，并做常規蘇木精?伊紅染色，病理證實診斷�；颊卟±斫M織活檢及術前均未接受任何放療或化療。
1.2 主要試劑和方法
羊抗人Ang?2(N?18)多克隆抗體為Santa Cruz公司產品，工作濃度1∶100。S?P免疫染色試劑盒購自北京中山生物公司。實驗方法：經10%甲醛固定標本，石蠟包埋后切片，一抗為1∶100 Ang?2多克隆抗體，二抗為生物素標記兔抗山羊IgG，三抗為ABC復合物，DAB液顯色，蘇木精復染，以PBS緩沖液代替一抗作空白對照，用已知的大腸癌陽性片作為陽性對照。
1.3 結果判斷標準
采用Ang?2陽性染色強度結合陽性細胞所占百分比作為判斷標準。在400倍顯微鏡視野下每張切片隨機觀察4個視野，將切片中平均陽性細胞比例及染色深淺分別記0～3分。切片中無陽性細胞為0分，陽性細胞<25%為1分，陽性細胞25%～50%為2分，陽性細胞>50%為3分;染色深度以多數細胞為準，無陽性細胞為0分，淡黃色顯色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。再按這兩項指標的積分相加將結果分為4級：0分為“-”;1～2分為“+”;3～4分為“?”;5～6分為“?”。其中“?”、“?”為強陽性表達。
1.4 統計學處理
用SPSS 10.0統計軟件行χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Ang?2在食管鱗癌組織及正常食管組織中陽性染色結果及分布
在食管癌組織中， Ang?2的陽性表達率為67.06%，陽性染色細胞呈棕黃色顆粒狀或線網狀染色，分布于胞質及胞膜，部分微小血管也可見Ang?2著色(圖1)。在正常食管黏膜組織中Ang?2多為陰性表達，少數為弱陽性表達(表1)。結果示Ang?2的表達在食管癌組織及正常組織之間比較，兩者間差異有統計學意義(P<0.05)。提示食管癌組織中Ang?2呈高表達。表1 食管鱗癌組織及正常食管組織中Ang?2表達組織類型
2.2 Ang?2的表達與食管鱗癌病理分級及浸潤、轉移的關系
Ang?2表達有明顯的異質性，強陽性表達的癌細胞常位于浸潤前緣或癌組織的邊緣，也有少量成纖維細胞和血管內皮細胞等間質細胞表達陽性;正常對照組只有少數呈弱陽性表達。Ang?2在不同病理分級中表達陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且Ang?2表達的陽性率與浸潤深度及淋巴結轉移相比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。提示Ang?2陽性表達率隨食管癌病理分級上升而升高(表2)。表2 食管鱗癌中Ang?2的表達與腫瘤病理分級及其浸潤、轉移的關系
3 討論
腫瘤性血管是一種高度不成熟的血管。它的生成需要依賴于腫瘤組織產生的促血管生成因子的作用，克服維持血管穩定的諸多因素，包括離斷血管周細胞、破壞血管生成的微環境及刺激內皮細胞的增生和遷移。在眾多的促血管生成因子中，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和Angs是現已發現的內皮細胞特異性因子，在控制血管生成過程中起著主導作用。Angs是惟一含受體激動劑及抑制劑的促血管生成因子，編碼4種結構相似的蛋白質，包括Ang?1、Ang?2、Ang?3和Ang?4，均能與內皮細胞膜上的酪氨酸激酶?2 (tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains?2，Tie2)特異性結合，作為調節血管穩定的信號，參與生理性及病理性的血管生成[2]。Angs家族中Ang?2基因定位于第8號染色體短臂上(8p23)，相對分子質量接近75 000。
天然的Ang?2是Ang?1拮抗劑，與受體Tie2結合，不能引起后者的磷酸化，從而可作為阻斷血管穩定的信號，離斷血管內皮細胞與周細胞的結合，引起血管的不穩定，使其更易接受其他促血管生成因子的刺激，在后者的共同作用下，引起腫瘤的血管生成，從而促進腫瘤的生長。目前研究[3-4]認為，Ang?1的表達與腫瘤血管形成的多少關系不大，而Ang?2表達是腫瘤血管新生起始及加強的因素，與腫瘤血管形成數目、臨床分期、預后關系密切。Peng等[5]在研究Ang?1和Ang?2在肝細胞癌異位表達中的生物學效應中認為血管生成素基因參與了肝細胞癌生長與演進，但Ang?1基因的表達沒有明顯增加腫瘤血管生長的作用，而Ang?2能促進腫瘤的血管生成。
Koga等[6]運用免疫組化技術檢測Ang?2在膠質瘤中的表達時發現Ang?2不僅表達在血管內皮細胞上，腫瘤細胞亦有表達，高表達的部位位于腫瘤周邊的血管生成區。Ang?2在參與腫瘤血管生成中的具體作用機制尚不清楚。陳林鶯等[7]在Ang?2對胃癌血管生成的雙向效應研究中發現Ang?2對胃癌血管生成具有雙向調節作用，即在Ang?2表達上調的情況下VEGF促進血管生成，而Ang?2抑制血管生成則與VEGF的表達無相關性。
本實驗結果表明，食管鱗癌組織中Ang?2的表達明顯高于正常組織，且食管鱗癌中Ang?2蛋白表達與其病理分級、浸潤程度及淋巴結轉移密切相關。腫瘤分化越差，Ang?2表達越強。有淋巴結轉移的Ang?2陽性率明顯高于無淋巴結轉移組，這說明Ang?2與腫瘤的侵襲轉移關系密切。Ang?2不僅在腫瘤相關血管的內皮細胞中有表達，而且在食管鱗癌組織中亦有表達，表明來源于腫瘤細胞的Ang?2很有可能參與了腫瘤血管的退化及新生血管的成熟。Ang?2在腫瘤組織中表達明顯高于正常組織，特別是Ang?2特異表達于腫瘤邊緣的血管重建區，參與腫瘤血管新生的起始及延續過程，影響腫瘤生長和轉移，并有望成為一種新的抗腫瘤血管新生靶向因子。其表達調控及活性調節的研究是目前闡明腫瘤血管新生機制并進行抗腫瘤血管新生治療的研究熱點及難點，所以這一研究仍有待于進一步深入。
【參考文獻】
[1] 閻曉初.食管疾病[M]//史景泉，陳意生.現代外科病理學.北京：人民軍醫出版社，1998：107.
[2] Li L Y, Barlow K D, Metheny?Barlow L J. Angiopoietins and Tie2 in health and disease[J]. Pediatr Endocrinol Rev,2005,2(3):399-408.
[3] Ahmad S A, Liu W, Jung Y D, et al. The effects of angiopoietin?1 and ?2 on tumor growth and angiogenesis in human colon cancer[J]. Cancer Res,2001,61(4):1255-1259.
[4] Etoh T, Inoue H, Tananka S, et al. Angiopoietin?2 is related to tumor angiogenesis in gastric carcinoma: possible in vivo regulation via induction of proteases[J]. Cancer Res,2001,61(5):2145-2153.
[5] Peng L, Sun J, Wang W D, et al. Biological effect of ectopic expression of angiopoietin?1 and ?2 in hepatocellular carcinoma cell line[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2003,2(1):94-97.
[6] Koga K, Todaka T, Morioka M, et al. Expression of angiopoietin?2 in human glioma cells and its role for angiogenesis[J]. Cancer Res,2001,61(16):6248-6254.
[7] 陳林鶯,張聲,林建銀,等.促血管生成素?2對胃癌血管生成的雙向研究[J].中華腫瘤雜志,2004,26(3):161-164.
