發布時間：2020-04-01所屬分類：醫學職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要目的確定以大腸桿菌表達丁肝抗原的最佳條件，為規模生產以求研發丁肝ELISA診斷試劑奠定基
摘要目的確定以大腸桿菌表達丁肝抗原的最佳條件，為規模生產以求研發丁肝ELISA診斷試劑奠定基礎。方法在不同溫度、時間、IPTG和菌種濃度條件下，分別進行蛋白表達，取等體積樣本進行SDS—PAGE電泳，經ImageLab軟件分析，比較目的蛋白表達量，確定最佳表達條件。結果在25℃、29~C、33oC和37~C條件下，蛋白表達量無統計意義的差別;在添加IPTG后的1、2、3、4、5和6h，表達量無統計意義的差別;在以0.25、0.5、1、2和4mmol/LIPTG誘導時，表達量無統計意義的差別。當添加誘導劑前，菌種的ODo。值分別為1.236、0.772、0.542和0.384，目的蛋白表達量有顯著意義的差別。以OD值為1.236和0.772時，表達量最高，兩者之間無統計意義的差別;OD。。值為0.542時，表達量次之;OD。。值為0.384時，表達量最低。結論溫度、表達時間和IPTG濃度在一定范圍內對丁肝抗原蛋白表達量無影響;菌種的濃度是影響蛋白表達量的決定性因素;當菌種濃度在OD值約為0.7～1.2時，以0.25mmol/LIPTG在37℃，誘導表達1h為最佳表達條件。該條件下，目的蛋白表達量占菌體總蛋白的41.5%。
關鍵詞丁肝基因工程抗原表達
丁型肝炎病毒(HDV)是一種缺陷型負鏈RNA病毒，需依賴乙型肝炎病毒(HBV)或其他嗜肝DNA病毒的幫助才能復制和傳播¨。HDV與HBV同時或重疊感染，可造成原有病情加重，或發展成為肝硬化甚至暴發性肝炎。我國是乙型病毒性肝炎的高流行區，當前乙型肝炎病毒表面抗原(HBAg)的陽性率仍大于8%E33，這說明丁型肝炎作為依托乙型肝炎病毒感染的疾病，仍嚴重威脅著我國人民的健康。只有對丁型肝炎及時準確的診斷，才能為其治療和防控工作奠定基礎。以酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定丁肝抗原或抗體是診斷丁肝的主要手段。為提高和改進我國當前HDVELISA診斷試劑的質量，大量獲取高純度、好活性的丁肝抗原是進一步開展研發工作的首要條件。本文從不同角度探討溫度、時間、誘導劑和菌種濃度等對丁肝抗原表達量的影響，從而確定其表達的最佳條件，為批量生產奠定基礎。
材料與方法
1.材料：丁肝抗原優化基因由北京六合通公司合成;表達載體M48由本室從商品化質粒PET43a改造并留存;BL21感受態(北京六合通公司);LB培養基(美國，Sigma);TZ一2H臺式恒溫振蕩培養箱(北京沃德創新醫藥科技中心);垂直電泳系統(美國，Bio—rad);蛋白彩色Marker(紐英倫生物技術北京有限公司);蛋白Marker(中國科學院上海生命科學研究院);GelDocXR+凝膠成像系統和ImageLab分析軟件(美·32·國，Bio—rad);H一15FR低溫離心機(美國，KOKUSAN);GGT一900超凈工作臺(北京半導體設備一廠);XMTD一6000電熱恒溫水槽(北京市長風儀器儀表公司);酶標儀(美國，Ther—mo)。
2.方法：(1)菌種的培養：將含丁肝抗原優化基因的M48質粒，常規轉化BL21感受態，挑取單斑菌，接種于1.5ml含100IXg/mlAmp的LB培養基中，37℃，240r/min，振蕩培養3h;再取該菌按1：100接種于3ml含100ixg/mlAmp的LB培養基中，37℃，240r/min，振蕩培養2h;再取該菌按1：1000分別接種于2.4L含100p~g/mlAmp的LB培養基中，30~C，240r/min，振蕩培養過夜;以含100Ixg/mlAmp的LB培養基做倍比稀釋，37℃，240r/min，振蕩培養1h后，作為測定不同溫度、時間和IPTG濃度對蛋白表達量影響的實驗用菌種。不同菌種濃度對蛋白表達量影響的實驗用菌，視過夜菌梯度稀釋后，在37oC，240r/min，振蕩培養過程中的OD值而采集。(2)不同條件下的蛋白表達：取lOOml的三角瓶，分裝30ml上述菌種，分別添加IPTG至終濃度為0.25、0.5、1、2、4mmol/L，同時設不加IPTG的對照，再依次分別置于25℃、29℃、33℃和37℃的恒溫震蕩培養箱內，240r/min，震蕩培養，每種不同條件的樣本均設3例。于培養1、2、3、4、5和6h時，以EP管分別取樣500IXl，lO000r/min，離心1min，棄上清，一20℃凍存備檢。(3)電泳：將上述樣本以5O1雙蒸水充分重懸，再加等體積2×Bufer，混勻，煮沸3min，取樣2Ol，以5%濃縮膠和13%分離膠進行常規SDS—PAGE。(4)軟件分析：以GelDocXR+凝膠成像拍照，留存;用ImageLab軟件對蛋白條帶進行分析。
結果
1.不同誘導劑濃度條件下蛋白表達結果：在IPTG濃度分別為0.25、0.5、1、2、4mmol/L的條件下，均有分子質量約為35kDa的外源性蛋白表達;且經ImageLab軟件分析，其表達量無統計意義的差別，如圖1示。
2.不同溫度條件下蛋白表達結果：在25℃、
29℃、33℃和37℃條件下，均有分子質量約為35kDa的外源性蛋白表達;且經ImageLab分析，其表達量無統計意義的差別，如圖2示。
3.不同表達時間蛋白表達結果：當表達時間分別l、2、3、4、5和6h時，均有分子量質約為35kDa的卜源性蛋白表達;且經ImageLab分析，其表達量無計意義的差別，如圖3示。
4.不同菌種濃度蛋白表達結果：誘導不同濃度的菌種，均有分子質量約為35kDa的外源性蛋白表達;經lmageLab分析，其表達量有統計意義的差別。在0Dn為1.236和0.772時，表達量最高，且兩者之間無統計意義的差別;ODomm為0.542時，表達量次之;ODo值為0.384時，表達量最低，如圖4示。
5.目的蛋白的含量：以lmageLab對表達產物進行定量分析，第6峰為目的蛋白(圖5)，約占菌體總蛋白的41.5%。
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討論
目前，大腸桿菌已成為現代分子生物學研究中最常用的材料之一，廣泛用于外源蛋白的原核表達。外源蛋白在大腸桿菌中的表達受多種因素的影響(5-]。
主要有外源基因的結構，表達載體和宿主菌的選擇，表達條件及營養狀況等。因此，對不同的基因必須對誘導條件進行優化，尋找適宜的表達條件，才能獲得最大程度的表達。
當異源目的基因的mRNA在大腸桿菌中過表達時，tRNA的數量直接反映了mRNA的密碼子偏倚性[。不充足的1RNA庫可能導致翻譯延遲、成熟前翻譯終止、翻譯移碼和氨基酸錯配。盡管少量稀有密碼子的出現通常不會給目的蛋白的合成造成太大影響，不過如果一個基因中含有成串或多個大腸桿菌稀有密碼子，外源蛋白的表達將非常低¨。為此，本研究所用基因采用人工編碼，選用大腸桿菌的高頻密碼子，避免因tRNA的稀有或缺少而導致的翻譯停止。湯少華等報道，丁肝病毒抗原蛋白編碼區約230bp的基因表達即可獲得有效的抗原蛋白，本研究所用基因優化后為596bp，所獲蛋白具有良好的抗原性(具體結果另文發表)。
本實驗選用含硫氧還蛋白的M48(系本室由PET43a改造而來)融合蛋白表達系統，借助硫氧還蛋白分子伴侶的作用¨，表達出的蛋白既能正確折疊又能表現出全部生物學活性。M48載體多克隆酶切位點的上游插入有編碼6個組氨酸的序列，可與目的蛋白融合表達，利用6xHisTag和金屬鎳的親和力所產生的螯合作用而設計的親和層析方法，可以有效純化此蛋白;同時，M48含T7強啟動子，該啟動子對T7RNA聚合酶啟動轉錄具有特異性，不僅轉錄效率高而且轉錄物完整，保證了表達rHDAg的完整性和高效性。
一般認為，溫度是影響蛋白表達的重要因素，溫度越高，蛋白表達量越大，且易形成包涵體’”’。本研究其他實驗已證實，此蛋白37℃表達依然可溶(結果另文發表)。本實驗進一步證實，在一定范圍內，溫度變化對其表達量無明顯影響。因37℃是大腸桿菌的最適生長溫度，所以確定在37℃進行表達。
蛋白表達時間一直是備受關注的問題，時間太短表達量少;時間長了又因蛋白酶的釋放而降解。因本研究采用BL21作為表達菌株，其蛋白酶含量極少，使表達蛋白不致被水解，為表達蛋白的穩定性提供了可靠保障。經本實驗證實，表達時間在一定范圍內對蛋白表達量無影響。
誘導劑IPTG是B一半乳糖苷酶底物的類似物，可與阻遏蛋白結合成復合物，使阻遏蛋白構象發生改變，不能與O基因結合，從而促進基因表達。因IPTG有潛在毒性，且價格昂貴，并不是表達蛋白的理想誘導物，目前因尚未找到合適替代品而沿用，但求用量減少。本實驗結果與相關研究一致，一定范圍內，增大IPTG的濃度并不能增加蛋白表達量¨。0.25mmol/L是不影響蛋白表達量的最低濃度。
本研究證實，誘導時的菌種濃度是決定蛋白表達量的主要因素。當OD為0.772時，誘導比較合適，細菌處于對數生長期，利于可溶性表達，且表達出的目的蛋白占菌體總蛋白的比例最高，約占41.5%。最終確定，當菌種生長至OD。。約為0.7時，以0.25mmol/LIPTG在37℃誘導1h為最佳表達條件，為丁肝抗原的大量表達奠定了實驗基礎。
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