發(fā)布時(shí)間：2019-12-02所屬分類：醫(yī)學(xué)職稱論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要背景：干細(xì)胞因其可向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化而在臨床神經(jīng)損傷疾病治療中具有廣闊的前景，但干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率不高，為此作者對傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法進(jìn)行了改良。目的：探討 2 種不同方法誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能及 2
摘要背景：干細(xì)胞因其可向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化而在臨床神經(jīng)損傷疾病治療中具有廣闊的前景，但干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率不高，為此作者對傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法進(jìn)行了改良。目的：探討 2 種不同方法誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能及 2 種誘導(dǎo)方法的優(yōu)劣。方法：采用組織塊法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，顯微鏡下觀察其形態(tài)并利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行干細(xì)胞鑒定，在神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)方案下，采用相同的誘導(dǎo)劑(2% B27、20 μg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 μg/L 表皮生長因子)，2 種不同的誘導(dǎo)方法將其向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化(傳統(tǒng)方法：將 B27、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子及青鏈霉素合劑加入 DMEM/F12 培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，3 d 后加入全反式維甲酸，共培養(yǎng) 10 d;改良方法：將 B27、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、青鏈霉素合劑及胎牛血清加入 DMEM/F12 培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，6 d 后用胰酶消化后重新接種于共聚焦小皿內(nèi)，次日去除 B27 和胎牛血清，并加入全反式維甲酸，共培養(yǎng) 14 d)。應(yīng)用免疫熒光染色對誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)志物——神經(jīng)絲蛋白(NF-M)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)進(jìn)行檢測，比較 2 種方法誘導(dǎo)后細(xì)胞表面神經(jīng)標(biāo)志物的陽性表達(dá)率。結(jié)果與結(jié)論：①成功分離出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定其高表達(dá) CD29、CD105，低表達(dá) CD34、 CD45，符合干細(xì)胞特性;②2 種方法誘導(dǎo)后，鏡下觀察到的細(xì)胞均可呈現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞樣改變，免疫熒光檢測提示 2 種方法誘導(dǎo)后細(xì)胞中神經(jīng)絲蛋白與膠質(zhì)纖維酸性蛋白均呈陽性表達(dá);③傳統(tǒng)方法組神經(jīng)絲蛋白與膠質(zhì)纖維酸性蛋白的陽性率分別為 18.73%和 18.01%，改良方法組二者的陽性率分別為 27.48%和 29.24%，兩組比較差異有顯著性意義(P < 0.05);④結(jié)果表明，2 種誘導(dǎo)方法均可將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞;但在誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)、神經(jīng)標(biāo)志物(神經(jīng)絲蛋白與膠質(zhì)纖維酸性蛋白)的陽性表達(dá)率方面，改良方法更具有優(yōu)勢。
關(guān)鍵詞：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;誘導(dǎo)分化;神經(jīng)細(xì)胞;神經(jīng)絲蛋白;膠質(zhì)纖維酸性蛋白;干細(xì)胞
0 引言 Introduction
間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于中胚層的非造血干細(xì)胞，其具有強(qiáng)大的自我更新、多向分化與免疫調(diào)節(jié)能力，已成為一種理想的種子細(xì)胞，并得到廣泛應(yīng)用[1-4]。間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛存在于身體的各種組織，易于分離和體外擴(kuò)增，已能在骨髓、滑膜、羊膜、臍帶、胎盤、臍血、脂肪、肺臟、肝臟等組織中被提取出[5-6]。目前已有研究證實(shí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells， HUMSCs)能夠分化為生殖細(xì)胞[7]、汗腺細(xì)胞[8]、前列腺樣上皮細(xì)胞[9]、心肌細(xì)胞[10]、視網(wǎng)膜前體細(xì)胞[11]、肝細(xì)胞[12]、胰島素分泌細(xì)胞[13]、內(nèi)皮細(xì)胞[14]、神經(jīng)組織[15]、軟骨組織等多種細(xì)胞和組織[16]。HUMSCs的培養(yǎng)具有取材方便、不違背倫理道德和法律要求等優(yōu)點(diǎn)[17]。此外，還有研究表明臍帶中干細(xì)胞的含量較骨髓高，故HUMSCs被廣泛認(rèn)可為替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最理想來源[18]。目前，將HUMSCs 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，在治療神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)損傷、腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中都取得了進(jìn)展[19-22]。
課題組前期實(shí)驗(yàn)采用了神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)法對 HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化進(jìn)行了初探，應(yīng)用含2% B27、20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 μg/L表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基對HUMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，免疫熒光檢測其表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白nestin[23]。前期實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率較低，為了探索一種安全、高效的誘導(dǎo)方法以滿足以后科研及臨床的需要，作者對前期的誘導(dǎo)方法進(jìn)行了改良，采用相同的誘導(dǎo)劑，對部分誘導(dǎo)劑的添加時(shí)間以及應(yīng)用時(shí)間進(jìn)行了調(diào)整，取得了一定的成效。另外，前期實(shí)驗(yàn)僅檢測了nestin蛋白，為進(jìn)一步明確誘導(dǎo)HUMSCs分化后的細(xì)胞是否為更加成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，作者在此次實(shí)驗(yàn)中選用了常用的神經(jīng)標(biāo)志物—神經(jīng)絲蛋白(neurofilament protein， NF-M)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fiber acidic protein， GFAP)作為檢測指標(biāo)，旨在探索一種更高效的誘導(dǎo)分化方法，并對HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能進(jìn)行初步探討。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 設(shè)計(jì) 細(xì)胞學(xué)體外觀察實(shí)驗(yàn)。
1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2014年5月至2015年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞室及分子生物實(shí)驗(yàn)室完成。
1.3 材料
1.3.1 臍帶 由新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院產(chǎn)科獲得足月分娩的健康新生兒臍帶，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬同意并簽署知情同意書，將其放入裝有無菌生理鹽水的50 mL離心管內(nèi)，4 h內(nèi)處理。
1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 倒置熒光顯微鏡、Leica Logo型熒光顯微鏡及成像系統(tǒng)(德國Leica公司);流式細(xì)胞儀(美國 Beckman公司);含有體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱(HF420) (力新儀器上海有限公司)。
1.3.3 實(shí)驗(yàn)試劑 0.25%胰蛋白酶溶液和胎牛血清 (Hyclone公司);青鏈霉素合劑(Sigma公司);FITC標(biāo)記的抗人CD105、CD29、CD45和CD34抗體(BD公司);表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(PeproTech公司); B27、DMEM/F12(Gibco公司);小鼠抗NF-M多克隆抗體 (H，M，R)(Cell Signaling公司);小鼠抗GFAP多克隆抗體 (BD公司);山羊抗小鼠IgG二抗(Alexa Flour 488)(Abcam 公司);40 g/L多聚甲醛(上海生工公司);Hoechst33342、 TritonX-100、全反式維甲酸(Sigma公司);體積分?jǐn)?shù)為10% 山羊血清(GIBCO公司)。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 HUMSCs的分離培養(yǎng) 采集足月分娩的健康胎兒臍帶，用0.1 mol/L PBS充分沖洗，去掉殘留血液。采用組織塊法培養(yǎng)[23]：剔除臍帶內(nèi)動(dòng)靜脈血管(1根臍靜脈，2根臍動(dòng)脈)，將剩余間質(zhì)剪成大小約1 mm3 的組織塊，均勻地放置在盛有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(55 mm)中，然后加入2 mL 胎牛血清固定組織塊。2 h后，按比例將含有青鏈霉素、維生素C、谷氨酰胺及碳酸氫鈉的試劑約8 mL加入低糖 DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，放置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。間隔3 d給予半量換液，鏡下觀察貼壁組織塊周圍的細(xì)胞生長情況。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到80%-90%匯合度時(shí)，采用0.25%胰酶消化并傳代，將組織塊移至另一個(gè)新的培養(yǎng)皿中，按照上述方法繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
1.4.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面分子標(biāo)志物 收集第3代 HUMSCs，經(jīng)胰酶消化后離心(1 200 r/min×5 min)使細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106 L-1，分別加入各種流式抗體： CD105、CD29、CD34、CD45等，常溫下孵育30 min， 0.1 mol/L PBS沖洗數(shù)次后，將其與FITC標(biāo)記(或PE)的二抗在避光條件下作用30 min，PBS充分洗滌后立即送檢。
1.4.3 HUMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞 取第3代 HUMSCs，以4 000/cm2 接種在直徑為3 cm的小皿內(nèi)。按如下2種方法進(jìn)行HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。 ①誘導(dǎo)法一(前期實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)方法)：將2% B27、20 μg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 μg/L表皮生長因子及青鏈霉素合劑加入DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，3 d后加入 0.5 μmol/L全反式維甲酸，隔日換液，10 d后在光學(xué)顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài);②誘導(dǎo)法二(改良的誘導(dǎo)方法)：將2% B27、20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子、20 μg/L 表皮生長因子、青鏈霉素合劑及體積分?jǐn)?shù)為2%胎牛血清加入DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，6 d后用胰酶消化，以 4 000/cm2 傳代，接種于直徑為3 cm的共聚焦小皿內(nèi)，次日用0.1 mol/L PBS清洗去除小皿內(nèi)2% B27和胎牛血清，并加入濃度為0.5 μmol/L全反式維甲酸，隔日半量換液1次， 14 d后在光學(xué)顯微鏡下觀察誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)。
1.5 主要觀察指標(biāo) 誘導(dǎo)分化后免疫熒光染色檢測 NF-M、GFAP的表達(dá)：使用40 g/L多聚甲醛對誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞予以固定，山羊血清封閉，分別加入NF-M抗體 (1∶500)和GFAP抗體(1∶500)并在4 ℃下孵育過夜， 0.1 mol/L PBS洗滌后加入山羊抗鼠二抗(1∶100)于室溫孵育60 min，0.1 mol/L PBS洗滌后Hoechst3342(0.5 mg/L) 復(fù)染細(xì)胞核，Leica倒置熒光顯微鏡觀察，應(yīng)用共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次以上，每次分別采集共聚焦圖片15張(放大250倍)，采用Image-Pro Plus6.0圖像處理分析軟件分別計(jì)算2種方法誘導(dǎo)后的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，以計(jì)量資料形式表示。2種方法分別設(shè)陰性對照(未加入NF-M及 GFAP)，應(yīng)用免疫熒光法檢測其細(xì)胞標(biāo)志物NF-M、GFAP 的表達(dá)。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，因資料不符合正態(tài)性，故采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05， P < 0.05為差異有顯著性意義。
2 結(jié)果 Results
2.1 HUMSCs形態(tài) 原代培養(yǎng)第3天，倒置熒光顯微鏡觀察可見組織塊外周有散在的細(xì)胞游出。培養(yǎng)第5-7天，大量細(xì)胞由組織塊中爬出，貼在皿底，呈長梭狀，類似于成纖維細(xì)胞，匯聚后細(xì)胞排列緊密，呈群落樣生長，聚合的細(xì)胞呈漩渦狀。組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞達(dá)90%-95%融合的時(shí)間為14-16 d，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，見圖1。傳代數(shù)小時(shí)后 HUMSCs快速貼壁，3-5 d后細(xì)胞可再次達(dá)到80%-90%的匯合度。經(jīng)過數(shù)代培養(yǎng)后，細(xì)胞形狀無明顯變化，增殖能力無明顯變化。
2.2 HUMSCs表型鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示 CD34、CD45表達(dá)為陰性，而CD29和CD105表達(dá)為陽性(陽性率分別為35.3%和95.9%)，符合HUMSCs的特征性標(biāo)記物表達(dá)，見圖2，提示組織塊法培養(yǎng)可獲得HUMSCs。
2.3 誘導(dǎo)HUMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞 HUMSCs通過 2種方法誘導(dǎo)后均可分化成為神經(jīng)元樣細(xì)胞，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化、胞體收縮形成突起呈星形，細(xì)胞之間網(wǎng)狀連接，形態(tài)與神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞近似。細(xì)胞生長狀態(tài)良好，可存活時(shí)間較長，改良方案誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化尤為明顯，細(xì)胞之間相互聯(lián)系的神經(jīng)微絲結(jié)構(gòu)明顯增多，明顯優(yōu)于前期實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)方法，見圖3。
2.4 免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)分化后細(xì)胞NF-M、GFAP的表達(dá) 免疫熒光染色提示HUMSCs用2種方法誘導(dǎo)后均可見 NF-M和GFAP呈陽性表達(dá)，表明誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的功能活性，見圖4，5。
2.5 免疫熒光定量NF-M與GFAP陽性表達(dá) 傳統(tǒng)方法組 NF-M和GFAP的陽性表達(dá)率分別為18.73%和18.01%;改良方法組NF-M和GFAP的陽性表達(dá)率分別為27.48%和 29.24%，后者明顯優(yōu)于前者，差異有顯著性意義(P < 0.05)，見表1。
3 討論 Discussion
HUMSCs最早由McElreavey等[24]于1991年在臍帶華爾通氏膠的黏液結(jié)締組織中分離獲得，因其培養(yǎng)取材方便、免疫原性低，并且在體外有較強(qiáng)的自我增殖與多向分化潛能等特點(diǎn)，已經(jīng)成為種子細(xì)胞的理想來源，其在細(xì)胞移植、組織工程材料、基因靶向治療等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值[17]。
間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法有貼壁培養(yǎng)法、胰酶或膠原酶消化法、免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀分選法、密度梯度離心法等多種，但目前尚無一種完美的方法，通常需要多種方法結(jié)合起來。課題組前期采用組織塊法和胰酶冷消化法體外培養(yǎng)HUMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明組織塊法培養(yǎng)出的HUMSCs形態(tài)保持良好的長梭形，而且增殖率快，可作為獲取充足數(shù)量干細(xì)胞的理想培養(yǎng)方法[23]。考慮到胰酶或膠原酶消化法容易對細(xì)胞造成損傷，流式細(xì)胞儀分選法成本高、操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求高，此次研究中HUMSCs 的培養(yǎng)仍采用成本低廉、操作簡單、對細(xì)胞損傷小的組織塊貼壁培養(yǎng)法。該研究對組織塊法分離培養(yǎng)的HUMSCs表面標(biāo)志物進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明CD29、CD105高表達(dá)(分別為35.3%和95.9%，且CD105表達(dá)大于95%)，而 CD34、CD45低表達(dá)，故其具有干細(xì)胞的顯著特征;課題組前期實(shí)驗(yàn)將HUMSCs培養(yǎng)傳代數(shù)次后觀察其仍具有很強(qiáng)的增殖能力，并通過EdU標(biāo)記證實(shí)其具有增殖功能活性[25]，這與既往報(bào)道的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性相似[26-28]。
近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞在骨、軟骨、脊髓損傷及多發(fā)性硬化、克羅恩病等疾病的臨床研究中愈來愈受重視[29]，目前HUMSCs已用于臨床2型糖尿病[30]、重度收縮性心力衰竭等疾病的治療[31]。干細(xì)胞對神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)一直是臨床關(guān)注的焦點(diǎn)[19-22]，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞能分泌多種免疫調(diào)節(jié)因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進(jìn)受損部位的神經(jīng)再生，安全有效地改善了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)后，其臨床療效已在腦癱、帕金森病、脊髓變性疾病、腦血管疾病等臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證[32]。目前認(rèn)為HUMSCs修復(fù)外周神經(jīng)系統(tǒng)受損的關(guān)鍵機(jī)制為其旁分泌作用[33]，也有學(xué)者認(rèn)為 HUMSCs可以通過白細(xì)胞介素8介導(dǎo)的分泌機(jī)制促進(jìn)受損的神經(jīng)功能恢復(fù)[34]。
當(dāng)前，體外誘導(dǎo)HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的方式包括化學(xué)法、中藥、神經(jīng)營養(yǎng)因子法、共培養(yǎng)法，還有學(xué)者利用腦脊液等進(jìn)行誘導(dǎo)分化的方法[35]。化學(xué)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞存活時(shí)間短[36]，且其誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞的特征性形態(tài)學(xué)變化表明其具有細(xì)胞毒性作用，可能不適用體內(nèi)移植。中藥可誘導(dǎo)HUMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，但是中藥發(fā)揮誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制尚需更近一步研究。而神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導(dǎo)劑為生物制劑，對細(xì)胞損傷小，安全性相對較高，為目前廣泛應(yīng)用的經(jīng)典誘導(dǎo)方法。
基于前期HUMSCs培養(yǎng)及其生物學(xué)特性觀察的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)[23，25]，該實(shí)驗(yàn)采用同樣的誘導(dǎo)劑，2種不同的誘導(dǎo)方法將HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化，并對2種誘導(dǎo)方法進(jìn)行了評價(jià)和比較。作者經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了2 種方法誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)均呈神經(jīng)細(xì)胞樣改變，免疫熒光化學(xué)檢測NF-M及GFAP均呈陽性表達(dá)，同時(shí)，在進(jìn)行NF-M 及GFAP免疫熒光染色時(shí)分別設(shè)置了PBS陰性對照組，除外免疫熒光假陽性的可能，故實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HUMSCs具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能。通過鏡下觀察及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)改良方法的細(xì)胞形態(tài)改變及神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物(NF-M和 GFAP)的陽性率明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，故改良方法是對前期誘導(dǎo)方法的有效改良。此結(jié)論可為后續(xù)HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化提供理論支持。
該實(shí)驗(yàn)2種誘導(dǎo)方法的主要不同之處在于改良方法的試劑中含有體積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清以及2種誘導(dǎo)法應(yīng)用 B27的時(shí)間長短不同。改良方法中體積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清在實(shí)驗(yàn)早期有助于促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長，為HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)，在7 d后及時(shí)去除胎牛血清，B27又可以減緩細(xì)胞生長，避免細(xì)胞生長過快、濃度過大而影響干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化過程中的形態(tài)變化及免疫熒光染色效果。傳統(tǒng)方法的試劑中雖然不含積分?jǐn)?shù)為2%的胎牛血清但含有B27，且在其誘導(dǎo)后期繼續(xù)應(yīng)用B27總共誘導(dǎo)了10 d，其誘導(dǎo)后的細(xì)胞生長旺盛，但呈神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)變化的細(xì)胞較少，免疫熒光染色中NF-M和 GFAP的陽性表達(dá)率也較低。孫麗等[37]采用丹參聯(lián)合生長因子誘導(dǎo)HUMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化后的GFAP陽性表達(dá)率為(25.6±2.6)%，與此實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，但其未檢測 NF-M;郜元軍等[38]比較了膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合胎腸培養(yǎng)基，維甲酸、ZnSO4聯(lián)合胎腸培養(yǎng)基誘導(dǎo)大鼠基質(zhì)干細(xì)胞分化為腸神經(jīng)細(xì)胞的效率，2種誘導(dǎo)法NF-M的陽性表達(dá)率分別為(75.6±8.4)%和(48.5±7.5)%，而GFAP均為陰性表達(dá)。郜元軍實(shí)驗(yàn)中NF-M的陽性率高于此次實(shí)驗(yàn)研究，考慮與兩者的實(shí)驗(yàn)對象、所用的誘導(dǎo)方法及試劑不同有關(guān)。此次實(shí)驗(yàn)過程中傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法在第10天左右細(xì)胞形態(tài)最佳，此后出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;而改良誘導(dǎo)方法在第14 天左右細(xì)胞形態(tài)最佳，僅出現(xiàn)少量細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，所以傳統(tǒng)誘導(dǎo)法的周期設(shè)定為10 d，而改良誘導(dǎo)方法為14 d，兩者沒能達(dá)到統(tǒng)一的誘導(dǎo)時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了HUMSCs可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，作者通過對前期的誘導(dǎo)方法進(jìn)行改良，明顯提高了HUMSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的效率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供了有力的保障。但是研究也存在不足之處有待改進(jìn)，目前常用神經(jīng)標(biāo)志物有神經(jīng)特異性烯醇化酶、NF-M、GFAP、β微管蛋白Ⅲ、微管相關(guān)蛋白等。該研究為系列探索性實(shí)驗(yàn)研究，前期實(shí)驗(yàn)檢測了神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白nestin，此次研究僅選用了神經(jīng)標(biāo)志物NF-M和GFAP作為檢測指標(biāo)，說服力仍顯不足，后續(xù)研究中課題組還將進(jìn)一步檢測微管相關(guān)蛋白、β微管蛋白Ⅲ等神經(jīng)標(biāo)志物以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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