發(fā)布時間：2019-10-19所屬分類：醫(yī)學(xué)論文瀏覽：1次
摘 要： 摘 要 ： 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，目前高通量整合分析技術(shù)是獲取最終生物學(xué)信息必不可少的重要手段，是對傳統(tǒng)藥物作用機理研究方法的一次革命性變革。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)及二者聯(lián)合應(yīng)用是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，近年來廣泛應(yīng)用在藥物作用機理研究相關(guān)
摘 要 ： 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，目前高通量整合分析技術(shù)是獲取最終生物學(xué)信息必不可少的重要手段，是對傳統(tǒng)藥物作用機理研究方法的一次革命性變革。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)及二者聯(lián)合應(yīng)用是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，近年來廣泛應(yīng)用在藥物作用機理研究相關(guān)的各個領(lǐng)域，如新藥開發(fā)、提高藥效和評價藥物毒性、指導(dǎo)藥物聯(lián)合治療等方面，已成為研究藥物作用機理中不可或缺的篩選階段。同時對轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、四種轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組聯(lián)合分析方法進(jìn)行了綜述，對不同聯(lián)合分析方法的優(yōu)缺點及存在的問題進(jìn)行簡要分析，闡述了近幾年兩組學(xué)聯(lián)合分析方法在藥物作用機理研究中的應(yīng)用，展望其下一步的發(fā)展前景與挑戰(zhàn)，以期探討轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)及其二者聯(lián)合應(yīng)用在藥物作用機制研究中的策略，為今后藥物作用的分子機理研究提供借鑒與參考，進(jìn)而基于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)發(fā)掘新的研究方法與途徑。
關(guān)鍵詞 ： 轉(zhuǎn)錄組學(xué) ;代謝組學(xué) ;轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組聯(lián)合分析方法 ;藥物作用機理
藥物作用機理的研究在新藥開發(fā)、提高藥效和評價藥物毒性、指導(dǎo)藥物聯(lián)合治療等方面具有重要作用。目前，研究藥物作用機理大多靠傳統(tǒng)藥理學(xué)方法[1]，然而這些傳統(tǒng)的策略在研究中具有局限性，主要集中在表觀遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)觀察或僅僅是分子靶點的鑒定等[2]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使用組學(xué)(Omics)這門新興技術(shù)采集生物學(xué)數(shù)據(jù)信息的方法越來越普遍。早期的研究傾向于僅使用一種組學(xué)來分析研究[3-4]，然而，越來越多的對于藥物作用機理的研究正在利用多組學(xué)聯(lián)合的技術(shù)手段開展[5-6]。多組學(xué)聯(lián)合分析的主要優(yōu)勢是通過這些整合的數(shù)據(jù)可以更好地分析生物體內(nèi)發(fā)生的細(xì)微變化，為預(yù)測生物體作用功能靶點提供更可靠的數(shù)據(jù)支撐。雖然在不同的文獻(xiàn)中介紹過不同組學(xué)的研究方法，但由于價格低廉等優(yōu)勢，在藥物作用機理研究中最常用的研究方法是轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組聯(lián)合分析，這種方法和策略在研究藥物作用機理方面發(fā)揮著重要作用。近年來，許多研究人員利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)對藥物作用機理進(jìn)行了大量的研究并且取得了一定的成果[6]。現(xiàn)今，轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組聯(lián)合分析已廣泛用于探索藥物作用機制的研究，本文主要從轉(zhuǎn)錄組學(xué)概念、代謝組學(xué)概念、轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組聯(lián)合分析概念及聯(lián)合分析的方法出發(fā)，闡述它們在藥物作用機理研究中的應(yīng)用，目的是探討轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)及其二者聯(lián)合應(yīng)用在藥物作用機制研究中的策略，從而不僅為今后藥物作用的分子機理研究提供借鑒與參考，并且希望能夠基于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)發(fā)掘新的研究思路與方法。
1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)
在完成人類基因組測序以及許多其他生物基因組測序后[7]，生命科學(xué)進(jìn)入了后基因組時代，功能基因組學(xué)成為了目前研究的主流方法。轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)是功能基因組學(xué)的重要組成部分[8]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究對象是一種細(xì)胞或組織的基因組所轉(zhuǎn)錄出來的 RNA 的總和，其研究目的是確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)并解釋基因功能，從而揭示藥物在機體中作用的相關(guān)機制[9]。
轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法包括基因芯片技術(shù)(Microarray)和高通量 RNA 測序技術(shù)(RNA Sequencing， RNA-Seq)[10]等。最初，研究人員通過雜交測序方法將數(shù)千個短 DNA 片段構(gòu)建成基因芯片，并通過與芯片上的特定位點探針靶向雜交來檢測這些基因的表達(dá)。目前為止，大量的基因芯片研究在人們對生物變化過程的理解方面提供了實質(zhì)性的幫助[11]，然而，由于其雜交靈敏度有限，很難檢測出低豐度的 mRNA。另一種轉(zhuǎn)錄譜分析方法是基于高通量測序儀的發(fā)展而出現(xiàn)的 RNA-Seq，該方法引入了測序和轉(zhuǎn)錄本數(shù)字化的概念，通過隨機剪切的短 cDNA 序列測序，計算 mRNA 的表達(dá)量。相比于前者，RNASeq 對功能基因組研究非常有效，能夠檢測出組織或細(xì)胞樣品內(nèi)全部基因表達(dá)譜。
這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法為解釋生物學(xué)功能中基因表達(dá)差異及尋找藥物在機體中的作用靶點都提供了有力的技術(shù)支持。Ujihira 等[12]通過基因芯片鑒定了 11 種與他莫昔芬反應(yīng)有關(guān)的小 RNA，其中之一是腫瘤抑制 miRNA，miR-574-3p。Kim 等[13]通過 RNASeq 研究了嗜油不動桿菌 DR1 的諾氟沙星耐藥性，分析了用諾氟沙星處理的 DR1 和 DR1 之間 RNA 的差異。以上兩項研究分別用了上述兩種方法，隨著科技發(fā)展，RNA-Seq 由于提高了檢測的特異性和準(zhǔn)確性越來越受到學(xué)者們的青睞。轉(zhuǎn)錄組測序雖然可以得到大量差異表達(dá)基因和調(diào)控代謝通路，但由于基因與表型之間很難直接關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致關(guān)鍵的藥物作用信號通路難以確定，因此往往很難達(dá)到預(yù)期的研究目的。
2 代謝組學(xué)
代謝組學(xué)(Metabolomics)是指定性定量測定活體系統(tǒng)內(nèi)經(jīng)病理生理刺激或遺傳修飾引起的動態(tài)變化的代謝物質(zhì)[1]，近來廣泛應(yīng)用于藥物毒理機制，疾病發(fā)生過程和藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域，特別是在新藥開發(fā)領(lǐng)域具有深遠(yuǎn)影響[14-20]。當(dāng)藥物作用時，隨著時間的改變，機體內(nèi)往往都伴隨著代謝物的微小變化，采用代謝組學(xué)現(xiàn)代分析技術(shù)，不僅可以測定這些微小變化的代謝物，并且通過對比代謝物可以發(fā)現(xiàn)特異性生物標(biāo)記物。傳統(tǒng)方法如利用生化指標(biāo)對藥物作用方式進(jìn)行評價時，往往只局限于對特定物質(zhì)進(jìn)行檢測而忽略了藥物對機體的整體影響，難以準(zhǔn)確反映生物系統(tǒng)對藥物作用引起的全面變化，如今利用代謝組學(xué)評價藥物對機體的作用能夠更加準(zhǔn)確全面的反映生物系統(tǒng)整體的動態(tài)變化，通過對變化的代謝物進(jìn)行測定，可為進(jìn)一步闡明藥物作用的分子機制提供強大的數(shù)據(jù)支撐。
代 謝 組 學(xué) 分 析 方 法 包 括 核 磁 共 振(Nuclear magnetic resonance，NMR)[21]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid chromatograph mass spectrometer，LCMS)[22]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(Gas chromatography mass spectrometer，GC-MS)[23] 等。 不 同 技 術(shù) 其 檢 測 偏向性不同，但不同平臺之間具有互補性。一般來說 NMR 的靈敏度最低，能檢測并定性的物質(zhì)少于 100 個，其優(yōu)勢是簡單、無損傷、可定量[24]等。質(zhì)譜的靈敏度大概是 NMR 的千倍，GC-MS 可檢測的物質(zhì)數(shù)量一般為 1 000 個以上，但由于對樣品要求比較嚴(yán)格，其應(yīng)用受到了一定限制[25]。雖然 LC-MS 檢測物質(zhì)的數(shù)量要比 GC-MS 少一些，但由于其避免了對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理等步驟，并且由于能夠方便的對樣本進(jìn)行定性定量分析而深受大眾青睞[26]。近年來越來越多學(xué)者利用代謝組學(xué)手段研究外源物質(zhì)在生物體內(nèi)的作用機制。王喜軍等[27]通過代謝組學(xué)研究方法輔以生物化學(xué)鑒定方法闡明了茵陳蒿湯對酒精性肝病大鼠具有良好的保肝作用。查偉斌等[28]基于 GC-MS 檢測技術(shù)的代謝組學(xué)方法，研究銀杏提取物對高脂誘導(dǎo)動脈粥樣硬化引起的代謝紊亂的作用，闡明銀杏提取物抗動脈粥樣硬化效果與其對脂質(zhì)代謝、膽酸合成及氨基酸代謝的調(diào)控密切相關(guān)。
然而，單一代謝組學(xué)方法并不足以闡述生物系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的各種變化，其方法在很大程度上取決于 1H-NMR、MS[29]和色譜的發(fā)展，另外，許多學(xué)者傾向?qū)Ｗ⒂谀骋谎h(huán)系統(tǒng)代謝物的分析，但循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的物質(zhì)變化是許多生物系統(tǒng)共同反應(yīng)的綜合結(jié)果，因此通過單一代謝組學(xué)研究并不能獲得對組織內(nèi)產(chǎn)生的具體反應(yīng)機制的全面闡述。另外，由于目前對代謝物種類分析的局限性，只依靠代謝組學(xué)研究結(jié)果難以對藥物作用機理進(jìn)行全面的生物學(xué)解釋[30]。
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SCI是國際期刊，對投稿論文要求極高，再加上語言差異，一般在SCI上發(fā)表論文的作者很少，所以研究植物的作者，對SCI期刊了解得不是很多。有想了解的作者，可以與期刊天空在線編輯聯(lián)系。
3 轉(zhuǎn)錄組-代謝組聯(lián)合分析方法
隨著高通量測序技術(shù)的完善和各種組學(xué)方法的成熟，不同組學(xué)的組合使用越來越受歡迎，然而研究過程中對于產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析是目前面臨的最大挑戰(zhàn)。通過整合不同組學(xué)數(shù)據(jù)來分析比較不同數(shù)據(jù)間的關(guān)系以及闡述綜合數(shù)據(jù)所說明的生物學(xué)問題才是最終研究目的，因此分析這些復(fù)雜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)工具必不可少。轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組聯(lián)合分析(Transcriptome-metabolism conjoint analysis) 中， 有多種數(shù)據(jù)整合分析的方法，包括基于相關(guān)性分析將數(shù)據(jù)結(jié)合的方法、基于級聯(lián)的集成方法、基于多變量整合的分析方法和基于代謝通路數(shù)據(jù)庫來整合分析數(shù)據(jù)的方法，學(xué)者們可以根據(jù)不同的生物學(xué)研究目的確定不同的聯(lián)合分析手段[31]。
3.1 基于相關(guān)性分析將數(shù)據(jù)結(jié)合的方法
通過聯(lián)合分析手段探索多元數(shù)據(jù)的簡單方法之一是尋找數(shù)據(jù)集之間的相關(guān)性。這里有兩種常用的方法，其中最常見的是 Pearson’s 和 Spearman’s 相關(guān)分析方法[32]。雖然科學(xué)家們期望通過此種方法找到代謝物與基因之間的關(guān)聯(lián)，然而僅使用這種單一方法往往不足以達(dá)到預(yù)期目的。雖然人們普遍認(rèn)為遵循中心法則的信息流動應(yīng)該符合層層遞進(jìn)的規(guī)律，然而 Kuile 和 Westerhoff[33]發(fā)現(xiàn) mRNA 與其相應(yīng)的代謝物之間并不符合預(yù)期的數(shù)量關(guān)系，并且 Moxley 等[34]也報道了酵母中轉(zhuǎn)錄物和代謝物之間的相關(guān)性非常低。
除了使用 Pearson's 或 Spearman's 等標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)外，還有 Goodman 和 Kruskal 伽馬檢驗[35]，這種分析方法僅考慮每種代謝物或基因的上調(diào)或下調(diào)，如用線性模型僅通過轉(zhuǎn)錄組的變化預(yù)測相應(yīng)代謝物變化趨勢[36]。事實上，直接利用相關(guān)系數(shù)來聯(lián)合分析兩組學(xué)數(shù)據(jù)存在一些潛在問題，分析過程中如果那些已知在路徑上密切相關(guān)的元素不表現(xiàn)出相關(guān)性，則我們需要通過其他的分析方法來給予輔助。
3.2 基于級聯(lián)的集成方法
基于數(shù)據(jù)級聯(lián)的集成方法是最早出現(xiàn)，且最簡單的方法之一，它可將多個組學(xué)數(shù)據(jù)集集合成單一模型。通過將每種組學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表匯總成單個數(shù)據(jù)表，應(yīng)用自組織映射[37-38]、K 均值聚類分析[39]或隨機森林[40]等算法進(jìn)行分析。Daub 等[41]介紹了一種在線軟件 MetaGeneAlyse，它可以通過運行上述標(biāo)準(zhǔn)方法來針對轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分別是從不同的分析技術(shù)中獲得的，其兩組數(shù)據(jù)集大小不一，這意味著數(shù)據(jù)集具有不同的標(biāo)注模式與結(jié)構(gòu)、不同的期望值、不同的底層噪聲分布和不同的方差，因此，從簡單連接的數(shù)據(jù)集中獲得代謝組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)之間的聯(lián)系并非易事。當(dāng)對連接的數(shù)據(jù)集進(jìn)行聚類時，來自不同數(shù)據(jù)集的元素將傾向于與其自身數(shù)據(jù)集中的其他元素聚類，從而可能會掩蓋組間關(guān)聯(lián)。
盡管需要進(jìn)行更多的研究來彌補這些局限性，但使用諸如 iCluster[42]這樣的工具可將這些問題最小化，這些潛在的分布差異影響可以通過去除信號低甚至沒有信號的元素將噪音的影響最小化。雖然通過預(yù)處理完全消除這些影響是不可能的，但是可以結(jié)合本文中的其他方法對代謝組 - 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，其結(jié)果的可信度會更高。
3.3 基于多變量的整合方法
除了前面描述的相對簡單的分析方法外，還可以利用多變量建模的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組 - 代謝組聯(lián)合分析。這種方法在用于生物學(xué)分析之前常用于化學(xué)計量學(xué)領(lǐng)域。兩種最常見的多變量分析方法是主成 分 分 析(Principal component analysis，PCA) 和偏 最 小 二 乘 回 歸(Partial least squares regression， PLSR)[43-44]。通過這種分析，研究人員可以利用一個數(shù)據(jù)集來預(yù)測另一個數(shù)據(jù)集并且找到兩個數(shù)據(jù)集之間的“協(xié)方差”關(guān)聯(lián)。與上述分析方法不同的是，這種方法可以將代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集保持在模型內(nèi)的獨立模塊中。
最早利用 PLS 模型整合代謝組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的是 Griffin 團(tuán)隊[45]。他們將兩組乳清酸處理大鼠的轉(zhuǎn)錄組與代謝組結(jié)合，用代謝組 NMR 光譜作為模型的 x 值，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為待預(yù)測的 y 值，隨后他們通過模型找出了各種與基因相關(guān)的代謝物。這種建模方法解釋了乳清酸對于大鼠脂肪肝作用的相關(guān)代謝物，同時結(jié)果也表明 1H-NMR 與基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合的方法有利于挖掘復(fù)雜生物系統(tǒng)中發(fā)生的微小反應(yīng)。這種模型同樣也被 Jauhiainen 等[46]以類似的方式預(yù)測轉(zhuǎn)錄譜中的相關(guān)代謝譜。在 Griffin 的方法中必須定義一種數(shù)據(jù)集作為 x，事實上這兩個數(shù)據(jù)集在模型中并非等價。因此，這種情況下，我們可以選擇更為泛化的評價方法，稱為 O2PLS[47]。正 交 偏最 小 二 乘 法 方 法(Orthogonal partial least squares，OPLS)是一種新發(fā)展起來的將正交信號校正方法與 PLSR 進(jìn)行結(jié)合對 PLSR 進(jìn)行修正的分析方法，而 O2PLS 是一種泛化的 OPLS，可在兩個數(shù)據(jù)矩陣中進(jìn)行雙向建模和預(yù)測。在這個算法中，x 和 y 是等價的，所以無論分配哪個數(shù)據(jù)集作為 x 或 y 無關(guān)緊要。Eveillard 等[48]用這種方法檢測了內(nèi)二(2- 乙基己基)鄰苯二甲酸酯暴露后的人體肝臟轉(zhuǎn)錄物和血漿代謝物。
